miniatura|Ilustración dos compoñentes básicos dun inmunoensaio, que inclúe un analito (verde), un anticorpo (negro) e unha etiqueta detectable (amarelo). Un inmunoensaio é unha proba bioquímica que mide a presenza ou concentración dunha macromolécula ou unha micromolécula nunha solución por medio do uso dun anticorpo (o máis habitual) ou un antíxeno. A molécula detectada polo inmunoensaio adoita denominarse "analito" e trátase en moitos casos dunha proteína, aínda que poden ser outro tipo de moléculas, de distintos tamaños e tipos, con tal de que se desenvolvan os anticorpos apropiados que teñen as propiedades axeitadas para o ensaio. Os analitos en líquidos biolóxicos como o soro sanguíneo ou urina mídense fecuentemente usando inmunoensaios para propósitos de investigación e médicos.
Os inmunoensaios poden ter diferentes formatos e variantes. Os inmunoensaios poden ser realizados en múltiples pasos con reactivos que se engaden e retiran por lavado ou que se separan en diferentes momentos do ensaio. Os ensaios multipasos chámanse a miúdo inmunoensaios de separación ou inmunoensaios heteroxéneos. Algúns inmunoensaios poden ser levados a cabo simplemente mesturando os reactivos coa mostra e facendo unha medición física. Ditos ensaios son denominados inmunoensaios homoxéneos, ou menos frecuentemente inmunoensaios de non separación.
Nos inmunoensaios adoita utilizarse un calibrador. Os calibradores son solucións que se sabe que conteñen o analito en cuestión, e a concentración dese analito xeralmente é coñecida. A comparación da resposta a un ensaio para unha mostra real coa resposta ao ensaio producida polos calibradores fai posible interpretar a intensidade do sinal en canto á presenza ou concentración de analito na mostra.
Principios
Os inmunoensaios baséanse na capacidade dun anticorpo de recoñecer e unirse a unha macromolécula específica en medio do que pode ser unha complexa mestura de macromoléculas. En inmunoloxía a macromolécula que se une ao anticorpo é un antíxeno e a área do antíxeno á cal se une o anticorpo denomínase epitopo.
Nalgúns casos, un inmunoensaio pode usar un antíxeno para detectar a presenza de anticorpos, que recoñecen ese antíxeno, nunha solución. Noutras palabras, nalgúns inmunoensaios, o analito pode ser un anticorpo en vez dun antíxeno.
Ademais da unión dun anticorpo ao seu antíxeno, a outra caracterísitca clave de todos os inmunoensaios é ter un medio de producir un sinal medible en resposta á unión. A maioría dos inmunoensaios, pero non todos, dependen da ligazón química de anticorpos ou antíxenos con algún tipo de etiqueta detectable. Existe un gran número de etiquetas en inmunoensaios modernos que permiten a detección por diferentes medios. Moitas etiquetas son detectables porque emiten radiación, ou producen un cambio de cor nunha solución, ou fluorescen baixo a luz, ou poden ser inducidos a emitir luz.
Historia
Rosalyn Sussman Yalow e Solomon Berson son considerados os desenvolvedores dos primeiros inmunoensaios na década de 1950. Yalow recibiu o Premio Nobel polo seu traballo en inmunoensaios en 1977.Rall JE. Solomon A. Berson. In "Biographical Memoirs". National Academy of Sciences 1990;59:54-71. . Fulltext .
Os inmunoensaios fixéronse considerablemente máis simples de realizar e máis habituais cando se demostraron as técnicas de encimas ligados quimicamente a anticorpos a finais da década de 1960.
En 1983, o profesor Anthony Campbell da Universidade de Cardiff substituíu o iodo radioactivo usado en inmunoensaios por éter de acridinio que emite a súa propia luz por quimioluminescencia. Este tipo de inmunoensaio utilízase agora en aproximadamente 100 millóns de tests clínicos cada ano en todo o mundo, o que permite aos médicos medir unha ampla variedade de proteínas, patóxenos e outras moléculas en mostras sanguíneas.
En 2012, a industria dos inmunoensaios comerciais gañou 17 mil millóns de dólares e pénsase que experimentará un lento crecemento anual do 2 ao 3%.
Etiquetas
Os inmunoensaios empregan diversas etiquetas para a detección de anticorpos e antíxenos. As etiquetas están normalmente ligadas quimicamente ou conxugadas co anticorpo ou antíxeno desexado. miniatura|Un ELISA sándwich realizado nunha placa de microtitulación.
Encimas
Unha das etiquetas máis usadas en inmunoensaios son os encimas. Os inmunoensaios que empregan encimas denomínanse ensaios inmunoabsorbentes de encima ligado (ELISAs), ou ás veces unmunoensaoio encimáticos (EIAs).
Entre os encimas usados en ELISAs están a peroxidase do ravo picante (HRP), a fosfatase alcalina (AP) ou a glicosa oxidase. Estes encimas adoitan permitir a detección porque producen un cambio de cor observable en presenza de certos reactivos. Nalgúns casos estes encimas son expostos a reactivos que causan que produzan luz ou quimioluminescencia.
Isótopos radioactivos
Os isótopos radioactivos poden ser incorporados en reactivos de inmunoensaios para producir un radioinmunoensaio (RIA). A radioactividade emitida por complexos anticorpo-antíxeno unidos pode detectarse doadamente usando métodos convencionais.
Os RIAs foron uns dos primeiros inmunoensaios desenvolvidos, pero o seu uso decaeu grandemente debido á dificultade e os riscos potenciais que supón traballar con radioactividade.
Reporteiros de ADN
Unha nova estratexia para realizar inmunoensios é combinar a reacción en cadea da polimerase cuantitativa en tempo real (RT qPCR) e as técnicas de inmunoensaios tradicionais. Esta técnica combinada chámase PCR inmunocuantitativa en tempo real (iqPCR) e utiliza como etiqueta unha sonda de ADN.
Reporteiros fluoroxénicos
Os reporteiros fluoroxénicos como a ficoeritrina utilízanse en varios inmunoensaios modernos. As micromatrices de proteínas son un tipo de inmunoensaio que emprega a miúdo reporteiros fluoroxénicos.
Etiquetas electrolminiscentes
Algunhas etiquetas funcionan por electroquimioluminescencia, na cal a etiqueta emite unha luz detectable en resposta á corrente eléctrica.
Inmunoensaios sen etiquetas
Aínda que nos inmunoensaios xeralmente se emprega algún tipo de etiquetas, hai tamén certo tipo de ensaios que non necesitan etiquetas, senón que utilizan métodos de detección nos que non se modifican ou etiquetan os compoñentes do ensaio. A resonancia plasmónica superficial é un exemplo de técnica que pode detectar a unión entre un anticorpo non etiquetado e antíxenos. Outro inmunoensaio sen etiqueta funciona medindo o cambio na resistencia nun eléctrodo cando se une a el un antíxeno.
Clasificación e formatos
miniatura|Nun inmunoensaio homoxéneo competitivo un analito non etiquetado despraza un analito etiquetado unido, que é despois detectado ou medido. Os inmunoensaios poden realizarse en diferentes formatos. Xeralmente, poden clasificarse nalgunha das seguintes categrías segundo o modo en que se fagan funcionar.
Inmunoensaios homoxéneos competitivos Nun inmunoensaio homoxéneo competitivo, o analito non etiquetado nunha mostra compite co analito etiquetado para unirse ao anticorpo. Despois, mídese a cantidade de analito non unido etiquetado. En teoría, canto máis analito haxa na mostra, máis analito etiquetado queda desprazado e máis alta dá a medición; por tanto, a cantidade de analito non unido etiquetado é proporcional á cantidade de analito na mostra. miniatura|esquerda|Os inumoensaios non competitivos de dous sitios adoitan consistir nun analito que queda en medio facendo un "sándwich" entre dous anticorpos. Os ELISAs xeralmente utilizan este formato.
Inmunoensaios heteroxéneos competitivos
Igual que nun inmunoensaio homoxéneo competitivo, o analito non etiquetado na mostra compite co analito etiquetado para unirse ao anticorpo. Nos ensaios heteroxéneos, o analito non unido etiquetado é separado ou retirado por lavado, e mídese o restante analito unido etiquetado.
Inmunoensaios non competitivos dun sitio
O analito descoñecido na mostra únese con anticorpos etiquetados. Os anticorpos etiquetados non unidos son retirados por lavado e mídense os anticospos etiquetados unidos. A intensidade do sinal é directamente proporcional á canidade de analito descoñecido.
Inmunoensaios non competitivos de dous sitios
O analito na mostra descoñecida únese ao sitio do anticorpo, despois o anticorpo etiquetado é unido ao analito. Mídese despois a cantidade de anticorpo etiquetado no sitio. Será directamente proporcional á concentrción do analito porque o anticorpo etiquetado non se une se o analito non está presente na mostra descoñecida. Este tipo de inmunoensaio é tamén coñecido como ensaio sándwich, xa que o analito queda situado en medio, facendo un "sándwich" entre os dous anticorpos.
Exemplos
Probas clínicas
Unha gran canidade de tests médicos son inmunoensaios, chamados neste contexto inmunodiagnósticos. Moitos tests de embarazo de usar en casa son inmunoensaios, os cales detectan o marcador do embarazo, que é a gonadotropina coriónica humana. Outros inmunoensaios clínicos son os tests que miden os niveis de CK-MB para avaliar as doenzas cardíacas, a insulina para avaliar a hipoglicemia, o antíxeno específico prostático para detectar ocancro de próstata e algúns outros úsanse tamén para a detección ou medición cuantitativa dalgúns compostos farmacéuticos (como na técnica de inmunoensaio multiplicada encimática).
Análises antidopaxe deportivos
Os inmunoensaios utilízanse en laboratorios antidopaxe deportiva para testar se as mostras de sangue dos atletas conteñen a hormona do crecemento humana recombinante (rhGH, rGH, hGH, GH) prohibida.
Investigación
Inmunoensaio fotoacústico
Os inmunoensaios fotoacústicos miden sinais acústicos de baixa frecuencia xerados por etiquetas de nanopartículas metálicas. Cando se iluminan con luz modulada a unha lonxitude de onda de resonancia plasmónica, as nanopartículas xeran un forte sinal acústico, que pode medirse usando un micrófono. O inmunoensaio fotoacústico pode ser aplicado a tests de fluxo lateral, que utilizan nanopartículas coloidais.
Notas
Véxase tamén
Bibliografía
David Wild (2008). The Immunoassay Handbook. Elsevier, 3ª edición. Susan R. Mikkelsen (2004). Bioanalytical Chemistry. Capítulos 5 e 6.
Outros artigos ELISA MELISA CEDIA Inmunocribado Proba de fluxo lateral Inmunoensaio magnético Radioinmunoensaio Inmunoensaio de fibra óptica envolvente (SOFIA) Inmunoensaio baseado en CD/DVD Aglutinación-PCR Inmunoensaio óptico
Ligazóns externas
Categoría:Métodos bioquímicos Categoría:Probas inmunolóxicas