miniatura|500x500px|Resumo da RNA-Seq. Nun organismo os xenes son transcritos e, nos organismos eucariotas, empalmados para producir os transcritos de ARNm maduro (en vermello). O ARNm é extraído do organismo, fragmentado e copiado en ADNc bicatenario estable (en azul). Este ADNc bicatenario é secuenciado utilizando métodos de secuenciación de lecturas curtas de alto rendemento. Estas secuencias poden despois ser aliñadas cunha secuencia xenómica de referencia para reconstruír as rexións xenómicas que van ser transcritas. Estes datos poden utilizarse para anotar onde están os xenes expresados, os seus niveis de expresión relativos e todas as variantes de empalme alternativas.
A RNA-Seq é unha técnica de bioloxía molecular que utiliza secuenciación de seguinte xeración para revelar a presenza e cantidade de ARN nunha mostra biolóxica nun momento dado, analizando o transcritoma celular en constante cambio.
Especificamente, a RNA-Seq facilita a capacidade de observar transcritos de xenes de empalme alternativo, modificacións postranscricionais, fusións de xenes, mutacións/SNPs e cambios na expresión xénica co tempo ou diferenzas en expresión xénica entre diferentes grupos ou tratamentos. Ademais dos transcritos e ARNm, a RNA-Seq pode analizar diferentes poboacións de ARN, incluíndo o ARN total, o ARN pequeno, como o miARN, o ARNt e o perfil ribosómico. A RNA-Seq pode tamén ser usado para determinar as fronteiras exón/intrón e verificar ou emendar os límites 3' e 5' anotados previamente. Os avances recentes en RNA-Seq inclúen a secuenciación de célula única e a secuenciación in situ de tecidos fixados.
Antes da aparición da RNA-Seq, os estudos de expresión xénica facíanse con hibridacións baseadas en micromatrices. Algúns problemas que tiñan as micromatrices son: artefactos de hibridación cruzada, deficiente cuantificación de xenes que se expresan pouco ou moito e necesidade de coñecer a secuencia a priori. Debido a estas técnicas, a transcritómica fixo a transición a métodos baseados na secuenciación. Estes progresaron desde a secuenciación de Sanger de bibliotecas de marcadores de secuencia expresada (ETS, Expressed Sequence Tag), a métodos baseados en etiquetas químicas (por exemplo, a análise en serie da expresión xénica) e finalmante á tecnoloxía actual, a secuenciación de xene seguinte de ADNc (notablemente a RNA-Seq).
Métodos
Preparación de bibliotecas
miniatura|upright=1.75|Esquema dos pasos a seguir nun experimento típico de RNA-Seq.
Os pasos xerais que hai que seguir para preparar unha biblioteca de ADN complementario (ADNc) para secuenciar descríbense máis abaixo, pero adoitan variar entre plataformas, e son:
Illamento do ARN: o ARN é illado dun tecido e mesturado con desoxirribonuclease (DNase). A DNase reduce a cantidade de ADN xenómico. O grao de degradación do ARN compróbase con electroforese en xel e electroforese capilar e é utilizado para asignar un número de integridade do ARN á mostra. Esta calidade do ARN e a cantidade total de ARN do comezo téñense en consideración durante os subseguintes pasos de preparación da biblioteca, secuenciación e análise. Selección/depleción do ARN: para analizar os sinais de interese, o ARN illado pode ser mantido como tal, filtrado para obter ARN con colas 3' poliadeniladas (poli(A)) para así incluír só os ARNm, eliminándose o ARNr), e/ou filtrado para ARN que se una a secuencias específicas (ver métodos de selección e depleción de ADN na táboa de máis abaixo). Os ARN con colas 3' poli(A) son secuencias codificantes procesadas maduras. A selección de poli(A) realízase mesturando ARN con oligómeros poli(T) unidos covalentemente a un substrato, normalmente boliñas magnéticas. A selección de poli(A) ignora o ARN non codificante e introduce un nesgo 3', o cal se evita coa estratexia de depleción de ARN ribosómico. O ARNr é eliminado porque supón un 90% do ARN da célula, que se se mantivese daría lugar a outros datos no transcritoma. Síntese de ADNc: o ARN é reversotranscrito a ADNc porque o ADN é máis estable e permite a amplificación (a cal usa ADN polimerases) e facer uso da tecnoloxía de secuenciación de ADN máis maduro. A amplificación que segue á transcrición inversa ten como resultado a perda da direccionalidade ou sentido da febra (strandedness), o cal se pode evitar co etiquetado químico ou secuenciación de molécula única. Realízanse a fragmentación e selección de tamaños para purificar secuencias que son da lonxitude axeitada para a máquina de secuenciación. O ARN, o ADNc, ou ambos son fragmentados con enzimas, por sonicación ou con nebulizadores. A fragmentación do ARN reduce o nesgo 5' da transcrición inversa cebada aleatoriamente e a influencia de sitios de unión ao cebador, co inconveniente de que os extremos 5' e 3' son convertidos en ADN menos eficientemente. Despois da fragmentación faise a selección por tamaños, na que ou ben se eliminan pequenas secuencias ou ben é seleccionado un estreito rango de lonxitudes de secuencias. Como se perden os pequenos ARNs como os microARNs, estes son analizados independentemente. O ADNc para cada experimento pode ser indexado cun código de barras hexámero ou octámero, para que estes experimentos poidan poñerse nun só carreiro de secuenciación multiplexada. Métodos de selección e depleción de ARN: Estratexia Tipo de ARN Contido en ARN ribosómicoContido en ARN non procesadoContido en ADN xenómicoMétodo de illamento ARN total Todo Alto Alto Alto Ningún Selección de poliA Codificante Baixo Baixo Baixo Hibridación con oligómeros poli(dT) Depleción de ARNr Codificante, non codificante Baixo Alto AltoEliminación de oligómeros complementarios do ARNr Captura de ARN Dirixido a diana Baixo Moderado Baixo Hibridción con sondas complementarias a transcritos desexados
Secuenciación de ARN pequeno/ARN non codiicante Cando se secuencian outros ARNs que non son ARNm, a biblioteca é modificada. O ARN celular é seleccionado baseándose no rango de tamaños desexado. Para dianas de ARN pequeno, como o miRNA, o ARN íllase por selección de tamaños. Isto pode ser realizado cun xel de exclusión por tamaños, por medio de boliñas magnéticas de selección de tamaños ou cun kit desenvolvido comercialmente. Unha vez illado, engádense linkers aos extremos 3' e 5' e despois son purificados. O paso final é a xeración de ADNc por transcrición inversa.
Secuenciación de ARN directa miniatura miniatura
Como se viu que a conversión de ARN en ADNc, a ligazón, amplificación e outras manipulacións da mostra introducen nesgos e artefactos que poden interferir tanto coa propia caracterización e a cuantificación de transcritos, A secuenciación de ARN directa de molécula única foi explorada por compañías como Helicos (que xa cerrou), Oxford Nanopore Technologies, e outras. Esta tecnoloxía secuencia as moléculas de ARN directamente de maneira masivamente paralela.
Secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq)
Os métodos estándar como as micromatrices e a análise RNA-Seq en masa estándar analizan a expresión de ARNs a partir de grandes poboacións de células. En poboacións de células mesturadas, estas medidas poden ocultar diferenzas esenciais entre células individuais nesas poboacións.""
A secuenciación de ARN de célula única ou scRNA-Seq (do inglés single-cell RNA sequencing) proporciona os perfís de expresión de células individuais. Aínda que non é posible obter a información completa de todo o ARN expresado por cada célula, debido á pequena cantidade de material dispoñible, os padróns de expresión xénica poden ser identificados por análises de clústeres de xenes. Isto pode desvelar a existencia de tipos raros de células dentro dunha poboación de células que nunca puideron observarse antes. Por exemplo, en 2018 foron identificados células especializadas raras do pulmón chamadas ionocitos pulmonares que expresan o regulador de condutancia de membrana da fibrose quística por dos grupos que realizaron unha scRNA-Seq dos epitelios das vías aéreas pulmonares.
Procedementos experimentais miniatura|Procedemento da secuenciación de ARN de célula única
Os protocolos actuais de scRNA-Seq comprenden os seguintes pasos: o illamento de célula única e ARN, transcrición inversa, amplificación, xeración de bibliotecas e secuenciación. Os métodos que apareceron inicialmente separaban as células individuais en pozos separados; os métodos máis recentes encapsulan as células individuais en pingas nun aparello microfluídico, onde ten lugar a reacción da transcrición inversa, convertendo os ARNs en ADNc. Cada pinga leva un "código de barras" de ADN que etiqueta unicamente o ADNc derivado dunha soa célula. Unha vez que se completa a transcrición inversa, pode mesturarse todo o ADNc de moitas células para a secuenciación; os transcritos dunha célula determinada identifícanse polo código de barras exclusivo.
Os retos aos que se enfronta a scRNA-Seq inclúen a conservación da abundancia inicial de ARNm nunha célula e a identificación de transcritos raros."" A etapa da transcrición inversa é fundamental, xa que a eficiencia da reacción de reversotranscrición (RT) determina canta poboación de ARN da célula será finalmente analizado polo secuenciador. A procesividade das transcriptases inversas e as estratexias de cebado usadas poden afectar á produción de ADNc de lonxitude completa e a xeración de bibliotecas nesgadas cara aos extremos 3’ ou 5' dos xenes.
No paso de amplificación, úsanse actualmente tanto a PCR coma a transcrición in vitro (IVT) para amplificar o ADNc. Unha das vantaxes de métodos baseados na PCR é a capacidade de xerar ADNc de lonxitude completa. Porén, as diferentes eficiencias da PCR sobre secuencias determinadas (por exemplo, o contido GC) poden tamén ser amplificadas exponencialmente, producindo bibliotecas con cobertura desigual. Por outra parte, mentres que as bibliotecas xeradas por IVT poden evitar o nesgo de secuencias inducido pola PCR, unha secuencia específica pode ser transcrita ineficazmente, causando así a desaparición (drop-out) de secuencias ou a xeración de secuencias incompletas. Publicáronse varios protocolos para a scRNA-Seq: Tang et al., STRT, SMART-seq, CEL-seq, RAGE-seq,, Quartz-seq. e C1-CAGE. Estes protocolos diferéncianse nas súas estratexias para a transcrición inversa, síntese de ADNc e a amplificación, e a posibilidade de aloxar códigos de barra específicos de secuencia (é dicir, UMIs) ou a capacidade de procesar mostras combinadas.
En 2017, introducíronse dúas estratexias para medir simultaneamente o ARNm e expresión proteica de célula única por medio de anticorpos etiquetados con oligonucleótidos coñecidas como REAP-seq, e CITE-seq.
Aplicacións
A scRNA-Seq está sendo amplamente usada en disciplinas biolóxicas como a bioloxía do desenvolvemento, neuroloxía, oncoloxía, enfermidades autoinmunes, e doenzas infecciosas.
A scRNA-Seq propiciou moitos avances na comprensión do desenvolvemento de embrións e organismos, como o verme Caenorhabditis elegans, e a planaria rexenerativa Schmidtea mediterranea. Os primeiros vertebrados que foron mapados desta maneira foron o peixe cebra e o anfibio Xenopus laevis. En cada caso foron estudados múltiples estadios do desenvolvemento do embrión, o que permite que o proceso de desenvolvemento completo sexa mapado célula por célula. A revista Science recoñeceu estes avances como o Logro do ano 2018.
Consideracións experimentais Cando se deseñan e realizan experimentos de RNA-Seq considéranse unha serie de parámetros:
Especificidade de tecido: a expresión xénica varía dentro dun tecido e entre diferentes tecidos, e a RNA-Seq mide esta mestura de tipos de células. Isto pode facer difícil illar o mecanismo biolóxico de interese. A secuenciación de célula única pode utilizarse para estudar cada célula individualmente, o que atenúa este problema.