Fosfolipase D (PLD) é uma enzima sensível a anestésicos e mecanossensível da superfamília de proteínas fosfolipase que catalisa a hidrólise de fosfolipídios de membrana.
A reação canônica é:
As fosfolipases ocorrem amplamente em bactérias, leveduras, plantas, animais e vírus. O principal substrato da PLD é a fosfatidilcolina, que ela hidrolisa para produzir o lipídio de membrana ácido fosfatídico (PA) e colina solúvel em um processo dependente de colesterol denominado .
As plantas codificam numerosas isoenzimas PLD, com pesos moleculares variando de aproximadamente 90 a 125 kDa. Em mamíferos, seis isoenzimas PLD (PLD1–PLD6) são expressas. e são as mais bem caracterizadas, responsáveis pela hidrólise clássica de fosfatidilcolina e sinalização de PA. Outras isoformas, como e , funcionam como nucleases endolisossomais em vez de fosfolipases, refletindo a diversificação da superfamília PLD.
A atividade da fosfolipase D desempenha papéis essenciais no , reorganização do citoesqueleto, , exocitose, migração celular e vias de transdução de sinal mais amplas. Além de suas funções catalíticas bem estabelecidas, as enzimas PLD são cada vez mais reconhecidas como reguladores chave da dinâmica da membrana e sinalização celular além da hidrólise de lipídios. O ácido fosfatídico gerado pela PLD não apenas atua como um lipídio de sinalização em si, mas também serve como um precursor para a biossíntese de outros segundos mensageiros lipídicos, incluindo diacilglicerol (DAG) e ácido lisofosfatídico (LPA). O ácido fosfatídico pode recrutar e regular diretamente uma variedade de proteínas efetoras a jusante, integrando assim a atividade da PLD em processos celulares complexos, como sinalização mTOR, detecção de e . Além dessas funções, as enzimas PLD contribuem para definir o limiar de sensibilidade à anestesia e força mecânica.
A desregulação da PLD tem sido implicada em várias condições fisiopatológicas, incluindo doença de Parkinson, doença de Alzheimer, câncer, diabetes mellitus e doenças autoimunes.
Descoberta A atividade do tipo PLD foi relatada pela primeira vez em 1947 por Donald J. Hanahan e I.L. Chaikoff. Não foi até 1975, no entanto, que o mecanismo de ação hidrolítico foi elucidado em células de mamíferos. Isoformas vegetais de PLD foram purificadas pela primeira vez a partir de repolho e mamona; PLDα foi finalmente clonada e caracterizada a partir de uma variedade de plantas, incluindo arroz, milho e tomate. PLDs vegetais foram clonadas em três isoformas: PLDα, PLDβ e PLDγ. Mais de meio século de estudos bioquímicos implicaram a fosfolipase D e a atividade de PA em uma ampla gama de processos fisiológicos e doenças, incluindo inflamação, diabetes, fagocitose, sinalização neuronal e cardíaca, e carcinogênese.
Função fisiológica Estritamente falando, a fosfolipase D é uma transfosfatidilase: ela media a troca de grupos polares covalentemente ligados a . Utilizando água como nucleófilo, esta enzima catalisa a da ligação fosfodiéster em fosfolipídios estruturais, como fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina. Os produtos desta hidrólise são o lipídio ligado à membrana ácido fosfatídico (PA) e colina, que se difunde no citosol. Como a colina tem pouca atividade de segundo mensageiro, a atividade da PLD é principalmente transduzida pela produção de PA. O PA está fortemente envolvido na transdução de sinal intracelular.
Além disso, alguns membros da superfamília PLD podem empregar álcoois primários, como etanol ou 1-butanol, na clivagem do fosfolipídio, catalisando efetivamente a troca do grupo polar do lipídio. Outros membros desta família são capazes de hidrolisar outros substratos fosfolipídicos, como cardiolipina, ou mesmo a ligação fosfodiéster que constitui a espinha dorsal do DNA.
Ácido fosfatídico
Muitas das funções celulares da fosfolipase D são mediadas pelo seu principal produto, o ácido fosfatídico (PA). O PA é um fosfolipídio carregado negativamente, cujo pequeno grupo polar promove a . Pensa-se, assim, que facilita a fusão membrana-vesícula e a fissão de uma maneira análoga à . O PA também pode recrutar proteínas que contêm seu correspondente, uma região caracterizada por regiões ricas em aminoácidos básicos. Além disso, o PA pode ser convertido em uma série de outros lipídios, como ácido lisofosfatídico (lyso-PA) ou diacilglicerol, moléculas de sinalização que têm uma infinidade de efeitos nas vias celulares a jusante. O PA e seus derivados lipídicos estão implicados em inúmeros processos biológicos que incluem tráfego de vesículas intracelulares, endocitose, exocitose, dinâmica do citoesqueleto de actina, proliferação celular, diferenciação e migração celular.
A PLD de mamíferos interage diretamente com quinases como PKC, , TYK e controla a sinalização, indicando que a PLD é ativada por essas quinases. Como a colina é muito abundante na célula, a atividade da PLD não afeta significativamente os níveis de colina, e é improvável que a colina desempenhe qualquer papel na sinalização.
O ácido fosfatídico, como uma molécula de sinalização, atua recrutando (SK1) para as membranas. O PA tem vida extremamente curta e é rapidamente hidrolisado pela enzima para formar diacilglicerol (DAG). O DAG também pode ser convertido em PA pela (DAG quinase). Embora PA e DAG sejam interconvertíveis, eles não agem nas mesmas vias metabólicas. Estímulos que ativam a PLD não ativam enzimas a jusante do DAG e vice-versa.
É possível que, embora PA e DAG sejam interconvertíveis, grupos separados de lipídios de sinalização e não sinalização possam ser mantidos. Estudos sugeriram que a sinalização de DAG é mediada por DAG poli-insaturado, enquanto o PA derivado de PLD é monoinsaturado ou . Assim, o PA saturado/monoinsaturado funcional pode ser degradado hidrolisando-o para formar DAG saturado/monoinsaturado não funcional, enquanto o DAG poli-insaturado funcional pode ser degradado convertendo-o em PA poli-insaturado não funcional.
Estrutura e mecanismo As PLDs vegetais e animais têm uma estrutura molecular consistente, caracterizada por sítios de catálise cercados por uma variedade de sequências regulatórias. O sítio ativo das PLDs consiste em quatro sequências de aminoácidos altamente conservadas (I-IV), das quais os II e IV são particularmente conservados. Esses domínios estruturais contêm a sequência peptídica catalítica distintiva HxKxxxxD (HKD), onde H, K e D são os aminoácidos histidina (H), lisina (K), ácido aspártico (D), enquanto x representa aminoácidos não conservativos. Esses dois motivos estruturais HKD conferem atividade hidrolítica à PLD e são críticos para sua atividade enzimática tanto in vitro quanto in vivo. A hidrólise da ligação fosfodiéster ocorre quando essas sequências HKD estão na proximidade correta.
Proteínas humanas contendo este motivo incluem: PGS1, , , , ,
A PLD que hidrolisa fosfatidilcolina (PC) é um homólogo da cardiolipina sintase, , PLDs bacterianas e . Cada uma dessas parece possuir uma duplicação de domínio que é aparente pela presença de dois motivos estruturais HKD contendo de histidina, lisina e asparagina bem conservados que podem contribuir para o ácido aspártico do sítio ativo. Uma endonuclease de Escherichia coli (nuc) e proteínas semelhantes parecem ser homólogos da PLD, mas possuem apenas um desses motivos.
Os genes PLD codificam adicionalmente domínios regulatórios altamente conservados: a (PX), o (PH) e um sítio de ligação para fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2).
Mecanismo de catálise A hidrólise catalisada por PLD ocorre através de um mecanismo "ping-pong" de dois estágios. Neste esquema, um resíduo de histidina de um motivo HKD ataca primeiro nucleofilicamente o átomo de fósforo do substrato fosfolipídico. Funcionando como um nucleófilo, a porção imidazol da histidina forma uma ligação covalente transitória com o fosfolipídio, gerando um intermediário fosfohistidina-fosfatidato de vida curta. Uma segunda histidina então ativa uma molécula de água para a hidrólise fácil da ligação fosfohistidina, regenerando o sítio ativo e liberando ácido fosfatídico. Resíduos de lisina auxiliam na coordenação do fosfato do substrato. Estudos estruturais mostraram que o sítio ativo é pré-organizado para permitir o ataque nucleofílico e confirmaram a presença de um intermediário fosfohistidina via captura covalente em estruturas cristalinas. A flexibilidade conformacional próxima ao sítio ativo pode ser necessária para permitir acesso eficiente ao substrato e catálise.
Especificidade do substrato As PLDs de mamíferos são seletivas para fosfatidilcolina. Embora resíduos conservados que contatam o esqueleto de glicerol e as cadeias de acila tenham sido identificados, nenhum resíduo único explica totalmente a especificidade da colina. A modelagem estrutural indica que rearranjos conformacionais do sítio ativo podem ser necessários para acomodar e posicionar a fosfatidilcolina para catálise.
thumb|right|upright=2|; PLD (oval azul) é sequestrada em domínios lipídicos dependentes de colesterol (lipídios verdes) por . PLD também se liga a domínios PIP2 (hexágono vermelho) (sombreamento cinza) localizados na região desordenada da célula com fosfatidilcolina (PC). Quando PIP2 aumenta na célula, PLD transloca para PIP2 onde é exposta e hidrolisa PC para ácido fosfatídico (lipídio esférico vermelho)
Mecanismo de ativação Para PLD2 de mamíferos, a base molecular da ativação é a . A enzima é sequestrada inativa em microdomínios lipídicos ricos em esfingomielina, mas esgotados de seu substrato PC. Um aumento local em PIP2 ou diminuição no colesterol faz com que a enzima se transloque para próximos ao seu substrato PC. A PLD é, portanto, ativada principalmente pela localização dentro da membrana plasmática, em vez de . Esses domínios lipídicos podem ser interrompidos por anestésicos ou força mecânica. A PLD também pode sofrer uma mudança conformacional após a ligação de PIP2, mas isso não foi demonstrado experimentalmente.
Isoformas Duas principais isoformas de fosfolipase D foram identificadas em células de mamíferos: e (53% de homologia de sequência), cada uma codificada por genes distintos. A atividade da PLD parece estar presente na maioria dos , com as possíveis exceções de e outros linfócitos. Ambas as isoformas de PLD requerem fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) como cofator para atividade. PLD1 e PLD2 exibem diferentes que mudam dinamicamente no curso da transdução de sinal. A atividade da PLD foi observada dentro da membrana plasmática, citosol, retículo endoplasmático (ER) e complexo de Golgi.
PLD1 é uma proteína de 120 kDa que está localizada principalmente nas membranas internas das células. Está presente principalmente no complexo de Golgi, endossomos, lisossomos e grânulos secretores. Após a ligação de um estímulo extracelular, PLD1 é transportada para a membrana plasmática. A atividade basal de PLD1 é baixa, no entanto, e para transduzir o sinal extracelular, ela deve primeiro ser ativada por proteínas como , , e proteína quinase C.
PLD2 Em contraste, PLD2 é uma proteína de 106 kDa que se principalmente na membrana plasmática, residindo em de membrana leve. Ela tem alta atividade catalítica intrínseca e é apenas fracamente ativada pelas moléculas acima. Regulação Além de divergir na atividade intrínseca com suas diferentes isoformas, a PLD é extensivamente regulada alostericamente por hormônios, neurotransmissores, lipídios, e outras pequenas moléculas que se ligam aos seus domínios de ligação correspondentes na enzima. Na maioria dos casos, a transdução de sinal é mediada pela produção de ácido fosfatídico, que funciona como um mensageiro secundário.