right|thumb|Los resultados del ABF en una red metabólica de las primeras seis reacciones de la glucólisis. El flujo predicho a través de cada reacción es proporcional al ancho de la línea. Las restricciones de importación de alpha-D-Glucosa and beta-D-Glucosa están representadas por barras rojas, y la función objetivo se encuentra marcada en rojo.
El análisis de balance de flujo (ABF) es un método matemático para analizar el metabolismo en un sistema biológico. A diferencia de otros métodos de modelaje, no requiere conocer previamente las concentraciones de los metabolitos o los detalles de la cinética enzimática del sistema. Se asume que el sistema bajo estudio se encuentra en estado estacionario. La técnica entonces intenta responder a la pregunta: dados algunos nutrientes conocidos, ¿cuál es el conjunto de flujos metabólicos que maximizan la tasa de crecimiento de un organismo preservando la concentración interna de metabolitos?
Un ejemplo notable del éxito del ABF es la capacidad de predecir con precisión la tasa de crecimiento del procarionte E. coli al ser cultivado en diferentes condiciones.Edwards, J., Ibarra, R. & Palsson, B. In silico predictions of Escherichia coli metabolic capabilities are consistent with experimental data. Nature Biotechnology 19, 125–130(2001). Los organismos apropiados para este análisis pueden ser cultivados en concentraciones de nutrientes definidas, midiendo sus tasas de crecimiento. Estas tasas de crecimiento experimentales son comparadas con las predicciones del ABF, lo que permite corregir el modelo con las observaciones.
Una buena descripción de los conceptos básicos de ABF se encuentra en el material suplementario de Edwards et al. 2001 (texto en inglés) el cual puede consultarse en el sitio web de Nature.http://www.nature.com/nbt/web_extras/supp_info/nbt0201_125/info_frame.html) Otros recursos son el libro "Systems Biology" de B. Palsson,Palsson, B.O. Systems Biology: Properties of Reconstructed Networks. 334(Cambridge University Press: 2006). y artículos por J. Orth,Orth, J.D., Thiele, I. & Palsson, B.Ø. What is flux balance analysis? Nature Biotechnology 28, 245-248(2010). por Lee et al. 2006Lee, J.M., Gianchandani, E.P. & Papin, J.A. Flux balance analysis in the era of metabolomics. Briefings in bioinformatics 7, 140-50(2006). y Feist et al. 2008.Feist, A.M. & Palsson, B.Ø. The growing scope of applications of genome-scale metabolic reconstructions using Escherichia coli. Nature biotechnology 26, 659-67(2008).
Preparación del Modelo Una guía para crear, preparar y analizar un modelo metabólico utilizando ABF, entre otras técnicas, fue publicada por Thiele y Palsson en 2010.Thiele, I. & Palsson, B.Ø. A protocol for generating a high-quality genome-scale metabolic reconstruction. Nature protocols 5, 93-121(2010). Las partes clave de la preparación del modelo son: anotar la red metabólica del sistema sin huecos, añadir restricciones al modelo y finalmente añadir una función objetivo (también llamada Función de Biomasa), para simular el crecimietno del organismo a modelar.
La Red Metabólica right|thumb|Las primeras seis reacciones de la Glucólisis preparadas para ABF mediante la adición de una función objetivo (rojo) y la importación y exportación de nutrientes (ATP, ADP, BDG, ADG) a través de las barreras del sistema (la línea punteada verde)
Las redes metabólicas pueden variar en alcance, describiendo el metabolismo en sólo una ruta metabólica, una única célula, un tejido o un organismo. El único requisito para ser usada en ABF es que la red no contenga huecos. Esto usualmente implica una curación manual, es decir, la revisión de artículos científicos por humanos para extraer las reacciones metabólicas reportadas en el sistema. La curación puede tomar meses o incluso años. Algunos programas computacionales (Simpheny,Schilling, C.H. et al. SimPheny: A Computational Infrastructure for Systems Biology. (2008). CellDesignerhttp://www.celldesigner.org y MetNetMaker) aceleran la anotación de nuevas redes listas para su uso en ABF.
Generalmente los modelos son creados en formato BioPAX o SBML de modo que se pueda llevar a cabo un análisis o visualización más profundo; sin embargo estos formatos no son un requisito de ABF.
Restricciones Un punto clave del Análisis de Balance de Flujos es la habilidad de añadir restricciones a las tasas de flujo de las reacciones en las redes, forzándolas a mantenerse dentro de un rango de valores seleccionados. Esto le permite al modelo simular con mayor precisión el metabolismo real. Las restricciones pueden dividirse en dos grupos: aquellas que regulan la ingesta y excreción de metabolitos, y aquellas que limitan el flujo a través de las reacciones metabólicas en el sistema. Los modelos metabólicos adaptados para ABF pueden ser analizados con COBRA toolboxBecker, S.A. et al. Quantitative prediction of cellular metabolism with constraint-based models: the COBRA Toolbox. Nature protocols 2, 727-38(2007). o FAME.Boele J, Olivier BG, Teusink B. FAME: the Flux Analysis and Modeling Environment. BMC Syst Biol 6(1): 8. PMID 22289213, http://f-a-m-e.org/
Medio de Crecimiento Los sistemas metabólicos requieren cierta entrada de nutrientes. Típicamente la tasa de obtención de nutrientes está regida por su diponibilidad en el medio (un nutriente que se encuentra ausente en el exterior no puede ser absorbido), su concentración y sus constantes de difusión (altas concentraciones de metabolitos con difusión rápida se absorben con mayor velocidad) y el método de absorción (marcando una diferencia entre transporte activo, difusión facilitada y difusión simple).
Si la tasa de absorción (o excreción) de ciertos nutrientes puede ser experimentalmente medida, la información puede añadirse como restricción a la tasa de flujo en los extremos del modelo metabólico. Esto garantiza que los nutrientes que no estén presentes o que no pueden ser ingeridos por el sistema no entren en su metabolismo (la tasa de flujo se restringe a cero), y que la simulación respete las tasas de absorción. Se provee así de un método secundario de asegurar que el metabolismo simulado contenga propiedades experimentalmente verificadas, que son algunas de todas las matemáticamente aceptables. En términos matemáticos, la aplicación de restricciones reduce el espacio de soluciones del problema en estado estacionario.
Restricciones internas Además de las restricciones aplicadas en los extremos de la red metabólica, se pueden constriñir las reacciones de la sección interna de la red. Estas restricciones son usualmente sencillas; pueden dirigir una reacción en sólo un sentido debido a consideraciones energéticas o pueden fijar un límite máximo en la velocidad de una reacción debido a la velocidad finita de todas las reacciones en la naturaleza.
Función Objetivo En ABF existe un gran número de soluciones matemáticamente aceptables para el problema del estado estacionario . Sin embargo algunas soluciones no tienen sentido biológico (no reflejan procesos que ocurran en la biología del sistema en la realidad), y las soluciones de interés son sólo aquellas que producen los metabolitos deseados en las proporciones correctas. El conjunto de metabolitos en proporciones correctas que el modelo de ABF intenta generar es llamado la función objetivo. Cuando se modela un organismo, la función objetivo es generalmente la biomasa del organismo y simula el crecimiento y la reproducción. La función de biomasa juega un papel muy importante en hacer los resultados del ABF aplicables biológicamente (al asegurar que la proporción de metabolitos producida por el metabolismo sea la correcta, por ejemplo) por lo que debe ser definida con sensibilidad o medida experimentalmente.
Al modelar redes más pequeñas la función objetivo se modifica de acuerdo a estas. Un ejemplo sería, en el estudio del metabolismo de la glucosa, definir la función objetivo como cierta proporción de ATP y NADH para simular la producción de metabolitos de alta energía por la ruta.
Descripción Matemática Una red metabólica se compone de nodos (metabolitos) conectados por aristas con dirección (reacciones), por lo que puede representarse como una matriz. Las propiedades de esta matriz son bien conocidas permitiendo analizar con computadoras problemas biológicos. Un sistema biológico real es extremadamente complejo. La medición de suficientes parámetros para definirlo es difícil e imprecisa, y hacer simulaciones puede consumir grandes cantidades de tiempo. El Análisis de Balance de Flujo simplifica la representación del sistema al requerir menos parámetros (tasas de cinética enzimática, concentraciones de compuestos y constantes de difusión entre otros), reduciendo considerablemente el tiempo computacional requerido para efectuar la simulación.
Un ejemplo sencillo center|400px|thumb|alt=Una red sencilla con dos reacciones y tres compuestos text|Una red sencilla con dos reacciones y tres compuestos Las concentraciones de todos los metabolitos y los flujos a través de todas las reacciones en este sistema pueden ser representados por las siguientes tres ecuaciones diferenciales.
Resolver este sistema de ecuaciones diferenciales no es difícil, pero rápidamente se vuelve computacionalmente caro conforme el número de ecuaciones en el sistema crece. Existe un segundo obstáculo en la resolución del sistema: las tasas de reacción and dependen de factores generalmente determinados por la teoría cinética de Michaelis-Menten, incluyendo los parámetros cinéticos de las enzimas y las concentraciones de los metabolitos. Aislar enzimas y medir sus parámetros cinéticos es una labor difícil, como lo es medir las concentraciones internas y las constantes de difusión de los metabolitos dentro del organismo. Por ello el acercamiento de ecuaciones diferenciales sirve únicamente para modelar el metabolismo los organismos más estudiados (link to Heinemann E. Coli paper with all internal fluxes measured and Manchester yeast paper with internal fluxes measured).
El poder de la homeostasis Gran parte del poder del ABF proviene de aplicar el principio de estado estacionario al problema. Asumiendo que las concentraciones de los metabolitos en un sistema biológico permaneces casi constantes en el tiempo podemos aplicar la condición homeostática de que las concentraciones de metabolitos no cambian en el tiempo:
Para el caso general:
Así el problema se simplifica a balancear los flujos en el sistema; de ahí al nombre de Análisis de Balance de Flujo.
Este conjunto de ecuaciones es más sencillo de resolver. Para el ejemplo la única solución es la solución nula .
La matriz estequiométrica thumb|alt=Stoichiometric matrix of the top of glycolsis|Una matriz estequiométrica para una red representando la glicólisis y la misma red tras ser preparada para ABF.
Las ecuaciones diferenciales pueden ser representadas usando matrices. La matriz estequiométrica de las ecuaciones de arriba es:
Las matrices estequiométricas se utilizan también en química, Análisis de Control MetabólicoReder, C (1988) Metabolic control theory: a structural approach. J Theor Biol. 135(2), 175-201. PMID 3267767 y sistemas dinámicos,Steuer, R and Junker, B H (2008) Computational Models of Metabolism: Stability and Regulation in Metabolic Networks in Advances in Chemical Physics, 142, 105-251 y son usualmente denotadas por la letra (refiriéndose al número en relación con la estequiometría, S está comúnmente reservada para la entropía). En Análisis de Balance de Flujo se denotan por la letra . En este punto es útil definir un vector en el que cada componente representa la tasa (o flujo a través) de la reacción respectiva dentro de la matriz estequiométrica.
La multiplicación de esta matriz, , con , es completamente equivalente a las ecuaciones derivadas directamente del diagrama de reacciones:
Aplicando la condición homeostática:
En general podemos escribir:
con el representando el vector nulo: