thumbnail|Resultado del Western blot: una membrana con las proteínas separadas en la electroforesis unidas, de las que sólo se disciernen aquellas contra las se ha añadido un anticuerpo. El western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica usada en biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres etapas para lograr esto: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente, visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados.
Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología.
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia, entre otros métodos. De esta misma forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a las otras proteínas.
La técnica «Western blot» fue desarrollada en la Universidad de Stanford. El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado por W. Neal Burnette, y consiste en un juego de palabras con una técnica análoga pero que usa ADN, el Southern (sureño en inglés) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern (norteño en inglés) (en el que se separa e identifica ARN), el Eastern (oriental en inglés) blot y el Southwestern (del suroeste en inglés) blot.
Pasos del Western blot
Preparación de la muestra Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un tampón de extracción. Después se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeñas) o por sonicación. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada. Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. Este proceso debe realizarse a baja temperatura (~4 °C) para evitar la desnaturalización proteica y con la adición de inhibidores de proteasas y fosfatasas para evitar la digestión de las proteínas y de las fosfoproteínas por las enzimas celulares. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas. center|750px
Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en función de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del tamaño.
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Transferencia Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad):
las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana - proteína, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrófoba. en las membranas de PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de dipolos entre la membrana y las proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque también son más frágiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas.
También pueden usarse otros soportes, como las membranas de nailon o el papel activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.
Difusión simple En la transferencia por difusión simple se ponen en contacto las superficies del gel electroforético y de la membrana y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán retenidas en ella.
Este protocolo no está muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de proteína transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificación que permite obtener múltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente idénticos. Esta modificación es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de proteína.
Transferencia al vacío En esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las proteínas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa. Este método es válido tanto para proteínas de alto como de bajo peso molecular.
Electrotransferencia Este método se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevar las proteínas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ánodo al positivo o cátodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en tampón de transferencia, gel, membrana, más papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.
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Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Azul de Coomassie (un colorante de proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere (especialmente en comparación con las otras técnicas).
Bloqueo Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse a las proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la detección puede unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-anticuerpo que se forma con la proteína que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA), leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20 o Tritón X-100. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos.
Detección En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a una enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la detección en un único paso, lo cual es útil en ciertos campos.
Método en dos pasos Los dos pasos de los que consta este método de detección son la unión del anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario. center|750px
Anticuerpo primario El primer paso es permitir la unión de un anticuerpo primario contra la proteína buscada. Este se consigue inoculando dicha proteína o uno de sus epítopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular. Además, como la proteína se ha desnaturalizado durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca específicamente la proteína desnaturalizada. La presencia del elemento extraño debería desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la producción del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la proteína.
Así pues, tras el bloqueo se incuba en agitación moderada la membrana con una disolución de anticuerpo primario (0,5 - 5 μg/ml). La disolución consiste en un tampón salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una pequeña fracción de detergente y, en ocasiones, proteínas disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disolución pueden ser introducidas en una pequeña bolsa de plástico. Esta incubación puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones más específicas.
Anticuerpo secundario Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. Este reconoce de forma específica una región concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unión a biotina, a una enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rábano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.
Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratón" es aquel capaz de reconocer casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: económicas, por permitir a un laboratorio compartir una única fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho más consistentes.
También pueden emplearse proteínas no anticuerpos, como las proteínas A y G.
Radiactividad thumb|300px|Unión del anticuerpo primario a la proteína de interés. A este se une la proteína A o la proteína G para ser detectada.