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Endo-β-1,3- glucanases (EC 3.2.1.39) são enzimas capazes de hidrolisar ligações glicosídicas presentes em carboidratos e pertencem a família das glicosídeo Hidrolases (EC 3.2.1). Catalisam normalmente a hidrólise de porções internas de ligações glicosídicas βbeta-1,3, em β- 1,3 glucanas que são polímeros de glicose na configuração anomérica &beta onde a ligação entre unidades glicosídicas se dá entre os carbonos 1 e 3. Esses polissacarídeos são abundantes na natureza, ocorrendo em algas, plantas superiores e fungos.Essas enzimas também estão envolvidas em reações de transglicosilação de ligações &beta-glicosídicas em Mizuhopecten yessoensis. Endo-β-1,3 glucanases são amplamente distribuídas, sendo encontrados em bactérias, fungos, plantas e animais, sendo importantes em diversos processos biológicos.
Parâmetros e Características descritas de Endo-β-1,3-glucanases
Denominações
Endo-β 1,3-glucanases hidrolisam β-D-glucanas, com uma especificidade alta e podem também hidrolisar outros substratos. As denominações dessa enzima podem variar de acordo com o substrato clivado, devido a isso, endo-β-1,3-glucanases podem possuir diferentes nomes tais como laminarinase; laminaranase; oligo-1,3-glicosidase; endo-1,3-β-glucanase; callase;β-1,3-glucanase; kitalase; 1,3-β-D-glucan 3-glicanohidrolase; endo-(1,3)-β-D-glucanase; (1→3)-β-glucan 3-glucanohidrolase; endo-1,3-β-D-glucanase; endo-1,3-β-glicosidase e,3-β-D-glucan glicanohidrolase. As variações de clivagem de substratos, tanto sintéticos quanto naturais podem ser uma útil ferramenta para se investigar não somente, o perfil de atividade da enzima, quanto predizer o tamanho do seu sítio catalítico.::
Tipos de Substrato descritos
Alguns substratos naturais comuns a Endo-β-1,3-glucanases são a Liquenana, laminoligossacarídeos, laminaribiose, laminaritriose, laminaritetraose, laminaripentaose, laminarihexaose, laminariheptaose, nitrophenil-beta-D-glucopiranosideo, O-β-D-glucopiranosil-D-glucopiranose, alpha-laminaribiosil fluorideo, β D glucana, calose, levedura, curdlan, carboximetil celulose, laminarina, pachyman, pendulana, entre outras variações que possuem diferentes grupos em ligação β com o D-glucana.
Curvas de velocidade
Para de determinar a velocidade da reação nessas enzimas, utiliza-se um ensaio do tipo descontínuo, observando-se a formação de produto ao longo do tempo. Como protocolo básico experimental, a enzima é incubada com substrato, em temperatura e tampão pré-determinados e que sejam adequados à mistura de reação. Após os intervalos regulares de ensaio, a reação precisa ser paralisada através da desnaturação da enzima, como por exemplo, a exposição da mesma, a altas temperaturas ou pela adição de algum reagente específico. No caso, de endo-β-1,3-glucanases, o produto liberado pela reação enzimática será detectado através da reação com o reagente ácido dinitrossalicílico, este método consiste na redução do ácido 3,5 dinitrossalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico ao mesmo tempo em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupo carboxílico, com o desenvolvimento de uma coloração avermelhada, lida em espectrofotômetro a 550nm4. Entretanto a equivalência entre o ácido amino-5-dinitrossalicílico produzido e a quantidade do açúcar não é exata e diferentes açúcares produzem diferentes intensidades na cor desenvolvida. Isso sugere que a química da reação deva ser mais complexa que a apresentada, podendo estar relacionada com as reações de decomposição de açúcares em solução alcalina. As enzimas podem ainda possuir a velocidade estimulada devido à presença de íons metálicos. Muitos íons foram descritos como estimulantes da atividade de Endo-&beta 1,3 glucanases, como Ba2+, Ca 2+,Co2+ ,Hg2+, K3Fe(CN)6,Mn2+,Na+e Zn2+. Dentre os compostos ativadores podemos citar mercaptoetanol-2, albumina de soro bovino, NaCl, Dietildiocarbonato de sódio, salicilato sódio,tripsina e CaCl2.Não existe registro na literatura da presença de cofatores para Endo-β 1,3 glucanases.
Purificação
A purificação consiste numa série de processos que removem contaminantes até a obtenção de um produto de elevado grau de pureza. Estes processos devem ocorrer em condições que mantenham a estabilidade da molécula a ser purificada, ou seja, deve-se evitar a degradação da proteína. As enzimas são purificadas pelo emprego sucessivo de métodos de fracionamento químico e físico. O objetivo de cada etapa é reter o máximo possível da enzima que se quer purificar e eliminar, também o máximo possível de outras proteínas, ácidos nucléicos e outras substâncias. A eficiência de cada etapa é dada por um rendimento ou recuperação e a purificação ou fator de purificação. Este processo este intimamente relacionado ao estudo de características moleculares e cinéticas de uma enzima. Endo-β 1,3 glucanases de diversos organismos e plantas já foram purificadas utilizando-se diversas técnicas, como a filtração em gel também conhecida como exclusão molecular, a partir do qual podemos estimar a massa molecular da enzima purificada. Este tipo de cromatografia de alta pressão juntamente com a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), permite definir em alguns casos, até mesmo a conformação da proteína. Outras técnicas, como quantificação de proteína, precipitação de proteína, processos cromatográficos e técnicas mais refinadas como difração de raios-X e espectrometria de massas também são utilizadas para este tipo de análise. O tamanho e a forma destas enzimas possuem uma estrutura com cerca de 80kDa de massa molecular para Aspergillus fumigatus , outras possuem 50kDa,como a espécie de inseto conhecida como Tenebrio molitor e 37.5 kDa em Spodoptera frugiperda.
Determinações de afinidade (Km)
Endo-β-1,3 glucanases apresentaram diferentes valores de Km sobre diferentes substratos. Para o substrato α-laminaribiosil florídeo foram encontrados os valores de Km variando de 9,7mM para Hordeum vulgare até 25,9mM para. Para Hordeum vulgare no substrato laminarina esse valor varia de 0,02 mM para Saccharomyces cerevisiae até 0, 688 mM para Cellulosimicrobium cellulans. Para a espécie Hordeum vulgare foi determinada a afinidade de endo-β 1,3 glucanase sobre diferentes substratos, neste caso a enzima apresentou maior afinidade pelo substrato laminarina quando comparado com α-laminaribiosil florídeo, 0,17 mM e 0,97 mM respectivamente. Estudos demonstraram eficiências catalíticas de até 237 s/mM sobre laminaripentaose, para Cellulosimicrobium cellulans. Até o presente momento, somente o modelo Cellulosimicrobium cellulans teve os valores de eficiência catalítica reportados.
Efeito de Inibição Considera-se um inibidor qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática, tais como íons, compostos ou até mesmo substratos, que podem se ligar não covalentemente à enzima. Um fenômeno comum em carboidrases que digerem polímeros e oligômeros é a inibição por substrato. Essa pode ocorrer quando a enzima tem uma grande extensão responsável por ligar o substrato e cada molécula deste associa-se com uma porção do sítio ativo. Eventos que levam a aparente inibição pelo substrato podem ser a transglicosilação8, perda de processividade e modos não produtivos de ligação. Durante a catálise, nas carboidrases há inicialmente a saída de parte do substrato do sítio ativo e a parte restante é transferida para uma molécula de água. Na reação de transglicosilação ela é transferida para outro carboidrato. Quando a concentração de substrato aumenta, esse pode tornar-se o aceptor do produto remanescente da enzima. Desse modo esse produto não é detectado e o que se verifica com o aumento da concentração de substrato é uma queda na velocidade de formação de produto. Processividade, ou grau de ataque múltiplo, é o número de ligações glicosídicas clivadas após a primeira, durante a formação de um complexo enzima-substrato. Quando ocorre perda de processividade, em muitos casos, tanto o sítio acessório quanto o catalítico estão ocupados, perdendo assim, a capacidade de realizar ataques múltiplos as cadeias do substrato. Nos modos não produtivos de ligação, a enzima torna-se incapaz de hidrolisar o substrato, devido a um erro no arranjo espacial do sítio de encaixe induzido da enzima, tornado-se improdutiva. Endo-β- 1,3 – glucanases hidrolisam laminarina e algumas podem ser inibidas por altas concentrações de substrato, seguindo os modelos descritos acima. Para Endo-β- 1,3 glucanases foram relatadas inibições totais da enzima e parciais, não possuindo uma definição objetiva, de que tipo de inibição ocorre. Dentre as constantes de inibição presentes na literatura para Endo-β-1,3 glucanases, podemos citar Ki de 1mM para Aspergillus versicolor. Como exemplos de moléculas inibitórias, podemos citar alguns exemplos como (2,3)-Epoxipropil beta-D-laminaribiose, 1-etil-3(-dimetilaminopropil) carbodiimide,2-mercaptoetanol , 3,4-epoxibutil-&beta-D-celobiosideo, 4-cloromercuribenzoato,AgNO3,Ca2+,carbodiimideo,Co2+,Cr2(SO4)3,EDTA,fidroximercuribenzoato,Pb2+,fenilmercurinitrato,óxido de propileno,SDS entre outras moléculas.
Influência do pH