β-glicosidases ou β-glicosídeo glicosil hidrolases representam um grupo de enzimas com funções variadas e fazem parte da família das glicosil hidrolases. Esta classe de glicosilase catalisa normalmente a hidrolise de ligações glicosídicas β-1,4, β-1,3 e β-1,6 a partir da extremidade não redutora de oligossacarídeos de cadeias pequenas, alquil e aril β-D-glicosídeos. Alguns exemplos são capazes de hidrolisar também β-D-galactosídeos, α-L-arabinosídeos, β-D-xilosídeos, β-D-fucosídeos. BRENDA - The Comprehensive Enzyme Information System - http://www.brenda-enzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=3.2.1.21. Estão também envolvidas em reações de transglicosilação de ligações β-glicosídicas em conjugados glicosídicos. Variações de β-glicosidases estão distribuídas em todos os tipos de organismos e possuem papéis importantes em diversos processos biológicos, dependendo da localização e do sistema biológico em que essas reações ocorrem.Harnpicharnchai , P., Champreda V., Sornlake, W., Eurwilaichitr, L., 2009. A thermotolerant b-glucosidase isolated from an endophytic fungi, Periconia sp.Protein Expression and Purification 67:61–69. Em microorganismos celulolíticos, por exemplo, elas são membros da família de enzimas celulolíticas que agem de maneira sinérgica convertendo celulose a glicose e esta pode ser convertida a etanol. Neste caso as β-glicosidases convertem resíduos de celobiose a glicose ou mesmo resíduos de celooligossacarídeos.
Velocidade de Reação B-glicosidases, possuem alta especificidade para β-D-glicosídeos e participam de diversas vias como, biossíntese de metabólitos secundários, degradação de celulose e linamarina entre outras e são assim capazes de hidrolisar diferentes substratos. Estas enzimas podem receber diferentes denominações de acordo com o substrato que hidrolisam e estes diferentes substratos sintéticos ou naturais são utilizados para determinação da atividade ou velocidade de reação da enzima. Alguns substratos naturais comuns são a linamarina, prunasina e amigdalina (glicosídeos cianogênicos), salicina (glicosídeo fenólico), celodextrinas, gentiobiose, apigenina, genistina e daidzina (isoflavonas), arbutina, laminarina, liquenano. E substratos sintéticos 4-metilumbeliferil-beta-D-glicopiranosídeo, 4-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo, 6-bromo-2-naftil-beta-D-glicopiranosídeo, (1-4)-beta-D-glucosil-D-mannobiose, (S)-citronelil beta-D-glucopiranosideo, entre outras variações que possuem diferentes grupos em ligação beta com o D- glicopiranosídeo. Estas diversas variações podem ser utilizadas para rastrear além da atividade o tamanho do sítio catalítico da enzima.
A velocidade de reação de uma enzima pode ser descrita pela equação ao lado e esta velocidade de reação pode ser determinada pela variação na formação de produtos ou no consumo de substratos : V= ∆ [S]/ ∆ t ou V= ∆ [P]/ ∆ t.
Para a enzima em questão a determinação da velocidade é feita pela formação de produtos ao longo do tempo em ensaios descontínuos. Neste caso a enzima é incubada com o substrato específico na presença de tampão e na temperatura adequada, após tempos pré-determinados a reação é paralisada pela desnaturação da enzima ou pela adição de base ou ácido. A quantificação da atividade deve ser feita utilizando uma curva padrão (Absorbância X nmol de produto formado). A velocidade deve ser medida em intervalos de tempo curtos, ou seja, velocidade inicial. A velocidade varia com a concentração de substrato, então se deve assegurar que apenas uma parte do substrato tenha sido consumida. Considera-se que a [S] permanece praticamente constante nos tempos iniciais de reação. Exemplo Utilizando o substrato p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo (pNP-β glic). A enzima é incubada com o substrato pNP-βglic em temperatura e pH pré determinadas. A reação é paralisada ao longo do tempo pela adição de carbonato de sódio (ou seja, basificação do meio), nestas condições o produto p-nitrofenol liberado reage com a base, formando o p-nitrofenolato de coloração amarelada que pode ser quantificado em espectofotômetro em 410 nm.
As enzimas podem ainda possuir a velocidade estimulada devido a presença de íons e compostos sem necessariamente estes sejam essenciais para atividade. Muitos íons e compostos foram descritos como estimulantes da atividade de β-glicosidase como cálcio, para bgls de Aspergillus niger, Clostridium stercorarium, Talaromyces thermophilus, cobalto, para Aspergillus japonicus, Zea mays, ferro para Aspergillus sp., magnésio para bgls de Pectobacterium carotovorum, Daldinia eschscholzii, manganês para Talaromyces thermophilus entre outros íons. Dentre os compostos ativadores podemos citar mercaptoetanol, DTT e alcoóis como etanol, metanol, butanol, propanol. B-glicosidase de Thermoascus aurantiacus possui aumento de 20-30 % em sua atividde na presença de metanol e para Ceratocystis paradoxa houve 160 % de ativação.
Purificação Β-glicosidases de diversos organismos e plantas já foram purificadas com o objetivo de conhecer suas características moleculares e cinéticas. Diversas técnicas podem ser utilizadas para este fim e a filtração em gel também conhecida como exclusão molecular, pode ser utilizada para estimar a massa molecular da enzima purificada. Este tipo de cromatografia acoplada a técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida, permite ainda saber em alguns casos se a proteína é dimérica, trimérica ou tetramérica. Outras técnicas mais apuradas como difração de raio x e espectrometria de massas também são utilizadas para este tipo de análise. O tamanho e a forma destas enzimas variam bastante dentro das diversas formas de vida. Enquanto algumas bgls possuem uma estrutura monomérica simples com cerca de 35 kDa de massa molecular Pleurotus ostreatus e 55 kDa Homo sapiens, alguns monômeros chegam a 110 kDa como de Fusarium oxysporum. Outras bgls são diméricas com massas variando de 160 a 240 kDa para algumas espécies de fungos, por exemplo, Aspergillus niger com 223 kDa, Aspergillus oryzae 218 kDa, 230 kDa (isoforma I) Penicillium funiculosum e ainda diméricas com massas menores como 50 kDa para Penicillium decumbens, 18 kDa (isoforma II) Penicillium funiculosum. Algumas são descritas como trímeros em torno de 300 kDa e ainda como tetrâmeros ou octâmeros. Para Evernia prunastri foi descrito uma β-glicosidase multimérica com subunidades de 60-70 kDa.
Determinação Parâmetros Cinéticos : Ks e Vmax Diversas β-glicosidases já foram purificadas como descrito acima o que permite a obtenção de parâmetros cinéticos que descrevem as características da enzima.Estes parâmetros podem ser determinados quando se obtem o valor da velocidade inicial da reação em diferentes concentrações do substrato utilizado. Para obtenção de valores acurados deve-se fazer o ensaio em diversas faixas de concentrações do substrato, concentrações até 10 vezes mais altas que o valor de Ks devem ser utilizadas para garantir que a Vmax foi atingida. Deve-se também manter a temperatura e a concentração da enzima constante ao longo dos ensaios. A constante Ks muitas vezes pode ser associada a afinidade da enzima pelo substrato, assim muitos estudos são feitos comparando o valor de Ks para diferentes substratos. Uma Ks menor indica maior afinidade da enzima por determinado substrato, ou seja maior parte da enzima total estará na forma ligada ao substrato. A Vmax está relacionada a Kcat que indica a capacidade de catálise da enzima em questão sobre o substrato estudado e depende da concentração de enzima utilizada no ensaio. A eficiência catalítica (Kcat/Ks) também pode ser utilizada para comparar diferentes substratos hidrolisados pela mesma enzima, ou para comparar enzimas de diferentes organismos atuando sobre o mesmo substrato. Estas constantes são descritas pela cinética de Michelis-Mentem e o plot de V X [S] gera uma curva hiperbólica. Para linearização dos dados e cálculo das constantes utiliza-se o plot de Lineweaver-Burk.
Na literatura pode se encontrar valores de Km para β-glicosidases de diversos organismos sobre diferentes substratos. Para o substrato pNP-βglic encontramos valores de Km variando de 0,001 mM para Penicillium funiculosum até 5,1 mM para Penicillium purpurogenum e de 10,34 mM para mutantes de Avena sativa. Para o substrato natural celobiose esse valor varia ainda mais de 0,002 mM para P. funiculosum até 220 mM para Schwanniomyces etchellsii. Para a espécie P. decumbens foi determinada a afinidade de β-glicosidase sobre diversos substratos, neste caso a enzima apresentou maior afinidade pelo substrato pNP-βglic quando comparado com as isoflavonas daidzina e apigenina, 0,97 mM e 0,54 mM respectivamente e de 0,83 mM para gentiobiose. Estudos demonstraram eficiências catalíticas de até 1640 s/mM sobre pNP-βglic, para Thermotoga maritima e de apenas 6,4 s/mM para Oriza sativa. Para Rhynchophorus palmarum foi descrito uma eficiência de 134,9 s/mM sobre celobiose e de 0,0085 s/mM para Oriza sativa.
Inibição Inibidores são substâncias (íons, compostos ou mesmo substratos), que se ligam de forma não covalente a enzima diminuindo a velocidade de reação. Estudos de inibição podem indicar a especificidade de uma enzima, arquitetura química e física do sítio ativo e o mecanismo cinético de reação.Irwin H. Segel, Enzyme Kinetics : Behavior and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems. Wiley-Interscience; New Ed edition 1993, ISBN 0-471-30309-7 Muitas enzimas podem ser inibidas pelos produtos das reações que catalisam. B-glicosidases por exemplo, hidrolisam celobiose e celodextrinas a glicose, e são assim competitivamente inibida por glicose. Os inibidores podem atuar de diferentes maneiras. Dentre os tipos de inibição mais comuns podemos citar inibição competitiva, inibição não-competitiva, inibição acompetitiva, inibição competitiva parcial, não-competitiva parcial e mista linear. Para β-glicosidases foram relatadas inibição competitiva e inibição não competitiva. Na inibição competitiva o inibidor apresenta semelhança estrutural com o substrato e compete com este pelo mesmo sítio ativo na enzima, assim quando o inibidor se liga o substrato não é mais capaz de se ligar.
Na inibição não competitiva o inibidor se liga a uma região diferente do sítio ativo e assim não impede a ligação do substrato, mas a ligação do inibidor impede a catálise pois causa uma reorganização do sítio ativo. Neste caso o inibidor permite a ligação do substrato mas não a catálise.
Nestes dois casos o tipo de inibição pode ser determinado analisando-se os gráficos recíprocos de 1/V x 1/[S] em diferentes concentrações do inibidor estudado. Na inibição competitiva à medida que se aumenta a concentração do inibidor no meio ocorre aumento de Ksap e a Vmax permanece a mesma. Na inibição não competitiva o valor de Ks permanece o mesmo e a Vmax ap diminui, com o aumento da concentração do inibidor. O valor de Ki pode ser obtido pelo gráfico de Dixon ou pelo replote das inclinações do gráfico de Lineawer Burk. Quanto menor a constante de inibição maior o grau de inibição a uma dada [S] e [I].