Proteína transformadora RhoA, também conhecida como membro A da família de homólogos de Ras (RhoA), é uma proteína GTPase pequena na que em humanos é codificada pelo gene RHOA. Embora os efeitos da atividade de RhoA não sejam todos bem conhecidos, ela está associada principalmente à regulação do citoesqueleto, principalmente à formação de fibras de estresse de actina e contratilidade de actomiosina. Ela atua sobre vários efetores. Entre eles, (proteína quinase 1 contendo bobina enrolada associada a Rho) e (Homólogo Diáfano 1, também conhecido como hDia1, homólogo a mDia1 em camundongos, diáfano em Drosophila) são os mais bem descritos. RhoA e as outras Rho GTPases fazem parte de uma família maior de proteínas relacionadas conhecida como , uma família de proteínas envolvidas na regulação e tempo da divisão celular. RhoA é uma das Rho GTPases mais antigas, com homólogos presentes nos genomas há 1,5 bilhão de anos. Como consequência, RhoA está de alguma forma envolvida em muitos processos celulares que surgiram ao longo da evolução. RhoA é especificamente considerada um fator regulador proeminente em outras funções, como a regulação da dinâmica do citoesqueleto, transcrição, progressão do ciclo celular e transformação celular.
Estrutura
O gene específico que codifica RhoA, RHOA, está localizado no cromossomo 3 e consiste em quatro éxons, que também foi associado como um possível fator de risco para derrame aterotrombótico.
Semelhante a outras GTPases, RhoA apresenta uma inserção Rho em sua sequência primária no domínio GTPase. RhoA contém também quatro locais de inserção ou deleção com um subdomínio helicoidal extra; esses locais são característicos de muitas GTPases da família Rho. Mais importante ainda, RhoA contém duas regiões de comutação (switch), Switch I e Switch II, cujos estados conformacionais são modificados após a ativação ou inativação da proteína. Ambos os interruptores têm dobramento característico, correspondem a regiões específicas na bobina RhoA e são estabilizados uniformemente por ligações de hidrogênio. As conformações dos domínios Switch são modificadas dependendo da ligação de guanosina difosfato (GDP) ou trifosfato de guanosina (GTP) a RhoA. A natureza do nucleotídeo ligado e a subsequente modificação conformacional dos domínios Switch determina a capacidade de RhoA de se ligar ou não a proteínas parceiras.
As sequências primárias de proteínas dos membros da família Rho são quase idênticas, com o terminal N contendo a maior parte da codificação de proteína para ligação e hidrólise de GTP. O terminal C de RhoA é modificado via prenilação, ancorando a GTPase nas membranas, o que é essencial para seu papel no crescimento celular e organização do citoesqueleto. Aminoácidos-chave envolvidos na estabilização e regulação da hidrólise de GTP são conservados em RhoA como Gly14, Thr19, Phe30 e Gln63.
A localização correta das proteínas RhoA é fortemente dependente do terminal C; durante a prenilação, a ancoragem do grupo prenil é essencial para a estabilidade, inibição e síntese de enzimas e proliferação. RhoA é sequestrada por inibidores de dissociação (RhoGDIs) que removem a proteína da membrana, impedindo sua interação posterior com outros efetores a jusante.
Mecanismo de ativação
RhoA adquire estados conformacionais inativos ligados a GDP e ativos ligados a GTP; esses estados alternam entre os estados ativo e inativo através da troca de GDP para GTP (conduzida simultaneamente via fatores de troca de nucleotídeo de guanina e fator ativador de GTPase). RhoA é ativada principalmente por fatores de troca de nucleotídeo de guanina (GEFs) via fosforilação; devido à grande rede de fosforilação sobreposta, uma infinidade de GEFs é utilizada para permitir vias de sinalização específicas. Esses arranjos estruturais fornecem locais de interação que podem interagir com efetores e fatores de guanina para estabilizar e sinalizar a hidrólise de GTP. Os níveis de ativação de RhoA e GEFs associados são medidos usando ensaios de pull down de RhoA e GEF que usam Rhotekin e grânulos de RhoA G17A mutantes, respectivamente.
Participação em processos celulares
RhoA está principalmente envolvida nessas atividades: organização de actina, contratilidade de miosina, manutenção do ciclo celular, polarização morfológica celular, desenvolvimento celular e controle transcricional.
Organização de actina
RhoA é prevalente na regulação da forma celular, polaridade e locomoção via polimerização de actina, contratilidade de actomiosina, adesão celular e dinâmica de microtúbulos. Além disso, acredita-se que RhoA atue principalmente na parte traseira () de células migratórias para promover o descolamento, semelhante ao processo de fixação e descolamento encontrado no mecanismo de adesão focal. As vias de transdução de sinal reguladas via RhoA ligam receptores da membrana plasmática à formação de adesão focal e à subsequente ativação de fibras de estresse de actina relevantes. RhoA estimula diretamente a polimerização de actina através da ativação de forminas relacionadas a diáfano, alterando estruturalmente os monômeros de actina para filamentos. As quinases induzem a contratilidade baseada em actomiosina e fosforilam TAU e MAP2 envolvidas na regulação de miosinas e outras proteínas de ligação à actina para auxiliar na migração e descolamento celular. A ação concertada de ROCK e Dia é essencial para a regulação da polaridade celular e organização dos microtúbulos. RhoA também regula a integridade da matriz extracelular e a perda das correspondentes adesões célula-célula (principalmente junções aderentes e estreitas) necessárias para a migração epitelial. O papel de RhoA na mediação da transdução de sinal também é atribuído ao estabelecimento da polaridade tecidual em estruturas epidérmicas devido à sua polimerização de actina para coordenar o movimento vesicular; o movimento dentro dos filamentos de actina forma redes que se movem em conjunto com o movimento linear vesicular. Como resultado, mutações presentes nos genes de polaridade indicam que RhoA é crítica para a polaridade tecidual e movimento intracelular direcionado.
Desenvolvimento celular
RhoA é necessária para processos envolvendo desenvolvimento celular, alguns dos quais incluem crescimento, fechamento dorsal, formação óssea e miogênese. A perda da função de RhoA é frequentemente atribuída à falha na gastrulação e incapacidade de migração celular. Por extensão, RhoA demonstrou funcionar como um interruptor intermediário dentro do processo global mediado mecanicamente de comprometimento e diferenciação de células-tronco. Por exemplo, as células-tronco mesenquimais humanas e sua diferenciação em adipócitos ou osteócitos são resultados diretos do impacto de RhoA na forma celular, sinalização e integridade do citoesqueleto. A forma celular atua como a principal pista mecânica que impulsiona a atividade de RhoA e a atividade do efetor a jusante ROCK para controlar o comprometimento das células-tronco e a manutenção do citoesqueleto. As vias mediadas pelo (TGF) que controlam a progressão e identidade tumoral também são frequentemente observadas como mecanismos dependentes de RhoA. O TGF-β1, um fator de crescimento supressor de tumor, é conhecido por regular o crescimento, diferenciação e transformação epitelial na tumorigênese. Em vez de bloquear o crescimento, o TGF-β1 ativa diretamente RhoA em células epiteliais enquanto bloqueia seu alvo a jusante, p160; como resultado, as vias dependentes de RhoA ativadas induzem a formação de fibras de estresse e subsequentes propriedades mesenquimais.
Controle transcricional
A RhoA ativada também participa na regulação do controle transcricional sobre outras vias de transdução de sinal via vários fatores celulares. As proteínas RhoA ajudam a potencializar a transcrição independente de fatores complexos ternários quando ativadas, enquanto modulam simultaneamente a atividade subsequente do sinal extracelular. Também foi demonstrado que RhoA media vias de sinalização induzidas por soro, LPA e AIF4, além de regular a transcrição do promotor c-fos, um componente-chave na formação do complexo ternário que produz os fatores séricos e ternários. A sinalização de RhoA e a modulação da polimerização de actina também regulam a expressão de Sox9 através do controle da atividade transcricional de Sox9. A expressão e atividade transcricional de Sox9 está diretamente ligada à perda da atividade de RhoA e ilustra como RhoA participa no controle transcricional da expressão de proteínas específicas.
Manutenção do ciclo celular
RhoA, bem como vários outros membros da família Rho, são identificados como tendo papéis na regulação do citoesqueleto e divisão celular. RhoA desempenha um papel fundamental na progressão do ciclo celular G1, principalmente através da regulação da expressão de e inibidores de quinase dependente de ciclina (p21 e p27). Essas vias de regulação ativam proteínas quinases, que subsequentemente modulam a atividade do fator de transcrição. RhoA suprime especificamente os níveis de p21 em linhas celulares normais e transformadas através de um mecanismo transcricional independente de p53, enquanto os níveis de p27 são regulados usando quinases efetoras associadas a Rho. A citocinese é definida pela contração baseada em actomiosina. Forminas relacionadas a diáfano dependentes de RhoA (DRFs) localizam-se no sulco de clivagem durante a citocinese enquanto estimulam a polimerização local de actina coordenando microtúbulos com filamentos de actina no local do anel contrátil de miosina. Diferenças na ligação do efetor distinguem RhoA entre outros homólogos de Ras relacionados GTPases. As integrinas podem modular a atividade de RhoA dependendo da composição da matriz extracelular e outros fatores relevantes. Da mesma forma, a estimulação de RhoA da atividade da quinase PKN2 regula a adesão célula-célula através da formação e desmontagem da junção apical. Embora RhoA seja mais facilmente reconhecida por suas contribuições únicas na contratilidade actina-miosina e formação de fibras de estresse, novas pesquisas também a identificaram como um fator-chave na mediação do pregueamento da membrana, formação de lamelas e bolhas de membrana (blebbing). A maior parte dessa atividade ocorre na borda principal das células durante a migração em coordenação com protrusões de membrana de carcinoma de mama.
Via RhoA
Moléculas agem em vários receptores, como NgR1, , , TROY e outros receptores desconhecidos (por exemplo, por CSPGs), o que estimula RhoA. RhoA ativa ROCK (RhoA quinase) que estimula a quinase LIM, que então inibe cofilina, que reorganiza efetivamente o citoesqueleto de actina da célula. No caso de neurônios, a ativação dessa via resulta no colapso do cone de crescimento, inibindo, portanto, o crescimento e reparo de vias neurais e axônios. A inibição dessa via por seus vários componentes geralmente resulta em algum nível de remielinização melhorada. Após isquemia global, o oxigênio hiperbárico (pelo menos a 3 ATA) parece suprimir parcialmente a expressão de RhoA, além da proteína Nogo () e uma subunidade de seu receptor Ng-R. A via de sinalização MEMO1-RhoA-DIAPH1 desempenha um papel importante na estabilização dependente de ERBB2 de microtúbulos no córtex celular. Um estudo recente mostra que a sinalização RhoA-Rho quinase media dano cerebral induzido por trombina.