miniatura|230px|Ilustración da SDS-PAGE. Os marcadores moleclares (escada) están no carreiro esquerdo A electroforese en xel de poliacrilamida (ou PAGE, do inglés polyacrylamide gel electrophoresis) é unha técnica amplamente usada en bioquímica, química forense, xenética, bioloxía molecular e biotecnoloxía para separar macromoléculas biolóxicas, xeralmente proteínas ou ácidos nucleicos, segundo a súa mobilidade electroforética. A mobilidade electroforética é función da lonxitude, conformación e carga da molécula. A electroforese en xel de poliacrilamida é unha ferramenta poderosa usada para analizar mostras de ARN. Cando o xel de poliacrilamida é desnaturalizado despois da electroforese, pode obterse información sobre a composición da mostra de especies de ARN. Existen principalmente dous grandes tipos de electroforese en xeles de poliacrilamida, que son: PAGE nativa (non desnaturalizante) e SDS-PAGE (desnaturalizante).
A poliacrilamida fórmase a partir da acrilamida. A hidratación de acrilonitrilo ten como resultado a formación de moléculas de acrilamida (C3H5NO) pola nitrilo hidratase. A acrilamida é tóxica para o sistema nervioso humano, polo que deben seguirse todas as medidas de seguridade cando se traballa con ela. Antes da adición de auga o monómero de acrilamida é un po, pero é soluble en auga, polo que engadindo auga se polimeriza formando a poliacrilamida. Ao facer xeles de poliacrilamida por medio da hidratación da acrilamida pode regularse o tamaño dos poros do xel. Un incremento das concentracións de acrilamida causa unha diminución do tamaño do poro do xel resultante da polimerización. O xel de poliacrilamida con poros pequenos é de grande axuda para examinar mellor moléculas máis pequenas, xa que as moléculas pequenas poden entrar nos poros e viaxar a través do xel, mentres que as moléculas grandes quedan atrapadas nas aberturas dos poros.
Como en todas as formas de electroforese en xel, as moléculas poden facerse "correr" no xel no seu estado nativo, conservando as estruturas de orde elevada das moléculas. Este método denomínase PAGE nativa. Alternativamente, pode engadirse un desnaturalizante químico para eliminar estas estruturas e converter a molécula nunha molécula sen estrutura cuxa mobilidade depende só da súa lonxitude (porque os complexos proteína-SDS teñen todos unha proporción masa-carga similar). Este procedemento chámase SDS-PAGE ou electroforese en xel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico. A SDS-PAGE é un método de separación de moléculas baseado nas diferenzas nos seus pesos moleculares. Ao pH ao cal se realiza a electroforese en xel as moléculas de SDS están cargadas negativamente e únense a proteínas nunha proporción establecida de aproximadamente unha molécula de SDS por cada dous aminoácidos. Deste modo, o deterxente dálle a todas as proteínas unha proporción uniforme carga-masa. Ao unirse ás proteínas o deterxente destrúe as súas estruturas secundaria, terciaria e cuaternaria, desnaturalizándoas e converténdoas en cadeas polipeptídicas aproximadamente lineais cargadas negativamente. Cando se someten a un campo eléctrico na PAGE, as cadeas polipeptídicas cargadas negativamente viaxan cara ao ánodo con diferente mobilidade. A súa mobilidade ou distancia á que viaxan as moléculas é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular. Comparando a proporción relativa da distancia viaxada por cada proteína coa lonxitude do xel (Rf) poden extraerse conclusións sobre o peso molecular relativo das proteínas, nas que a lonxitude do xel é determinada pola distancia viaxada por unha pequena molécula usada como tinguidura de control (tracking dye).
Para os ácidos nucleicos, o desnaturalizante máis comunmente usado é a urea. Para as proteínas úsase o dodecil sulfato sódico (SDS), que é un deterxente aniónico aplicado ás mostras proteicas para cubrir as proteínas e facer que incorporen dúas cargas negativas con cada molécula de SDS unida en cada dous aminoácidos da proteína desnaturalizada. O 2-mercaptoetanol pode tamén utilizarse para distorsionar as pontes disulfuro establecidas entre os complexos proteicos, o que axuda a desnaturalizar mellor a proteína. Na maioría das proteínas, a unión de SDS á cadea polipeptídica causa unha distribución homoxénea da carga por unidade de masa, o que ten como resultado o fraccionamento polo seu tamaño aproximado durante a electroforese. As proteínas que teñen un maior contido hidrofóbico (por exemplo, moitas proteínas de membrana, e aquelas que interaccionan con surfactantes no seu ambiente nativo) son intrinsecamente máis difíciles de tratar axeitadamente usando este método, debido á maior variabilidade na proporción de SDS unido. Procedimentalmente, poden usarse xuntas a PAGE nativa e a SDS-PAGE para purificar e separar as diversas subunidades dunha proteína. A PAGE nativa mantén a forma oligomérica intacta e mostrará unha banda no xel que é representativa do nivel de actividade. A SDS-PAGE desnaturaliza e separa a forma oligomérica nos monómeoros que a constitúen, mostrando bandas que son representativas dos seus pesos moleclares. Estas bandas poden utilizarse para identificar e avaliar a pureza da proteína.
Procedemento
Preparación da mostra
As mostras poden ser calquera material que conteña proteínas ou ácidos nucleicos. Estas poden ter unha procedencia biolóxica directa, por exemplo de células eucariotas ou procariotas, tecidos, virus, mostras ambientais ou proteínas purificadas. No caso dos tecidos sólidos ou células, estes adoitan ser primeiro rotos mecanicamente usando un batedor (para grandes volumes de mostra), ou un homoxenizador (para pequenos volumes), por sonicación ou ciclado a alta presión, e pode usarse unha combinación de técnicas bioquímicas e mecánicas, como diversos tipos de filtración e centrifugación, para separar os distintos compartimentos celulares e orgánulos antes da electroforese. Biomoléculas sintéticas como oligonucleótidos poden utilizarse tamén como analitos.
miniatura|Redución dunha ponte disulfuro típica polo DTT por medio de dúas reccións secuenciais de intercambio tiol-disulfuro.
A mostra a analizar pode opcionalmente mesturarse cun desnaturalizante químico se se desexa, xeralmente o SDS para o caso das proteínas ou a urea para os ácidos nucleicos. O SDS é un deterxente aniónico que desnaturaliza as estruturas secundarias, e as terciarias non unidas por pontes disulfuro, e xera ademais unha carga negativa en todas as proteínas en proporción á súa masa. A urea rompe as pontes de hidróxeno entre os pares de bases dos ácidos nucleicos. Quentar a mostra a polo menos 60 °C promove unha maior desnaturalización.
Ademais do SDS, as proteínas poden opcionalmente ser tratadas brevemente con calor ata preto a ebulición en presenza dun axente redutor, como o ditiotreitol (DTT) ou o 2-mercaptoetanol (beta-mercaptoetanol/BME), que axuda a desnaturalizar as proteínas ao reducir quimicamente as pontes disulfuro, debilitando así algunhas formas de pregamento terciario das proteínas, e rompendo a estrutura cuaternaria da proteína (sepáranse as subunidades do oligómero). Este método denomínase SDS-PAGE redutora.
Pode engadirse á solución unha tinguidura de control, que adoita ter unha maior mobilidade electroforética que os analitos e permite ao experimentador trazar o avance da solución a través do xel durante o percorrido electroforético.
center
Preparación de xeles de acrilamida
Os xeles constan normalmente de acrilamida, bisacrilamida, o desnaturaliante opcional (SDS ou urea), e un tampón cun pH axustado. A solución nalgunhas ocasións pode ser desgasificada ao baleiro para previr a formación de burbullas de aire durante a polimerización. Alternativamente, pode engadirse butanol ao xel de resolución (para proteínas) despois de que se verte este, xa que o butanol elimina as burbullas e fai a superficie máis lisa.
Engádese unha fonte de radicais libres e un estabilizador, como o persulfato amónico e o TEMED para iniciar a polimerización. A reacción de polimerización crea un xel debido á bisacrilamida engadida, a cal pode formar enlaces cruzados entre dúas moléculas de acrilamida. A proporción de bisacrilamida/acrilamida pode variarse con propósitos especiais, pero xeralmente é de 1 parte por cada 35. A concentración de acrilamida do xel pode variarse tamén, xeralmente entre o 5% e o 25%. Os xeles con porcentaxe baixa son mellores para resolver moléculas de peso molecular moi elevado, mentres que cómpren porcentaxes moito máis altas de acrilamida para resolver pequenas proteínas. O diámetro medio do poro dos xeles de poliacrilamida está determinado pola concentración total de acrilamidas (% T, onde T = concentración total de acrilamida e bisacrilamida) e a concentración do axente que forma os enlaces cruzados, a bisacrilamida (%C, onde C = concentración de bisacrilamida). O tamaño do poro redúcese reciprocamente á %T. En canto á %C, a concentración do 5% produce os poros máis pequenos, xa que a influencia da bisacrilamida no tamaño do poro describe unha gráfica con forma de parábola co vértice no 5%.
center
Os xeles adoitan polimerizarse entre dúas placas de vidro nun molde de xel, cun peite inserido na parte superior para crear os pozos para depositar a mostra. Despois de que o xel foi polimerizado o peite pode ser eliminado e o xel está listo para iniciar unha electroforese.
center
Electroforese Na PAGE utilízanse varios sistemas rampón dependendo da natureza da mostra e do obxectivo experimental. Os tampóns utilizados no ánodo e cátodo poden ser o mesmo ou diferentes.
center
center
Aplícase un campo eléctrico a través do xel, causando que os ácidos nucleicos ou as proteínas cargadas negativamente migren a través do xel afastándose do eléctrodo negativo (que aquí é o cátodo, dado que é unha cela electrolítica en vez de galvánica) e achegándose ao eléctrodo positivo (o ánodo). Dependendo do seu tamaño, cada biomolécula móvese de xeito diferente a través da matriz do xel: as pequenas moléculas deslízanse máis facilmente a través dos poros do xel, mentres que as máis grandes teñen máis dificultade. O xel faise "correr" xeralmente durante unhas poucas horas, aínda que isto depende da voltaxe aplicada ao xel; a migración ocorre máis rapidamente a voltaxes maiores, pero estes resultados son normalmente menos exactos que os obtidos aplicando voltaxes baixas. Pasado o período de tempo establecido, obsérvase que as biomoléculas migraron a diferentes distancias segundo o seu tamaño. As biomoléculas máis pequenas viaxan a máis distancia ao longo do xel, mentres que as grandes permanecen preto do punto de orixe. Deste xeito, as biomoléculas poden ser separadas de forma moi aproximada de acordo co seu tamaño, o cal depende principalmente do peso molecular en condicións desnaturalizantes, pero depende tamén das conformacións de orde superior en condicións nativas. A mobilidade no xel defínese como a migración viaxada cun gradiente de voltaxe de 1V/cm e mídese en unidades de cm2/sec/V. Con fins analíticos, a mobilidade relativa das biomoléculas, Rf, a proporción da distancia que viaxou a molécula no xel con respecto á distancia total que se desprazou a tinguidura de control represéntase graficamente fronte ao peso molecular da molécula (ou ás veces o logaritmo de MW, é dicir, a masa molar media, ou o Mr, o raio molecular). Estes gráficos ou plots tipicamente lineais representan os marcadores estándar ou curvas de calibración que son amplamente utilizados para a estimación cuantitativa de diversos tamaños moleculares.
Porén, certas glicoproteínas, compórtanse de forma anómala nos xeles con SDS. Ademais, a análise de proteínas máis grandes de entre 250 000 e 600 000 Da tamén pode ser problemática debido a que eses polipéptidos se moven impropiamente nos sistemas de xeles que se adoitan utilizar.
Procesamento posterior miniatura|esquerda|Dous xeles de SDS-PAGE despois de completada a electroforese