miniatura|Secuencia de eventos que hai que seguir nos exames por phage display para identificar polipéptidos, que se unen con alta afinidade ás proteínas diana desexadas ou secuencias de ADN. A phage display é unha técnica de laboratorio para o estudo de interaccións proteína-proteína, proteína-péptido, e proteína-ADN, que usa virus bacteriófagos (que infectan bacterias) para conectar as proteínas coa información xenética que as codifica. Nesta técnica, un xene que codifica unha proteína de interese insírese nun xene de cuberta viral de fago, o que causa que o fago "mostre, presente, expoña ou exhiba" (en inglés "display") a proteína no seu exterior cando contén o xene para a proteína no seu interior, o que ten como resultado unha conexión entre o xenotipo e o fenotipo. O termo pode traducirse por "exhibición ou presentación en fagos", pero raramente se usa traducido. Estes fagos que exhiben proteínas poden despois ser examinados contra outras proteínas, péptidos ou secuencias de ADN para detectar a interacción entre as proteínas exhibidas e esas outras moléculas. Deste modo, poden examinarse grandes bibliotecas de proteínas e amplificarse nun proceso chamado selección in vitro, que é análogo á selección natural.
Os bacteriófagos máis comúns usados na phage display son os fagos filamentosos M13 e fd, aínda que tamén se teñen utilizado o fago T4, o T7 e o λ.
Historia
A phage display foi descrita primeiramente por George P. Smith en 1985, cando demostrou a exhibición de péptidos en fagos filamentosos ao fusionar a información xenética do péptido de interese no xene III do fago filamentoso. Unha patente de George Pieczenik que reclamaba a prioridade desde 1985 tamén describía a xeración de bibliotecas de phage display.US patent 5866363 , Pieczenik G, "Method and means for sorting and identifying biological information", published 1999-02-02 Esta tecnoloxía foi despois desenvolvida e mellorada por varios grupos no Laboratorio de Bioloxía Molecular do Medical Research Council de Cambridge con Greg Winter e John McCafferty, no Instituto de Investigación Scripps con Lerner e Barbas e no Centro de Investigación do Cancro de Alemaña con Breitling e Dübel para a exhibición de proteínas como os anticorpos para a enxeñaría de proteínas terapéuticas.
Principio
Igual que o sistema de dous híbridos, o phage display utilízase para o exame de alto rendemento de interaccións proteicas. No caso do display no fago filamentoso M13, o ADN que codifica a proteína ou péptido de interese é ligado nos xenes pIII ou pVIII, que codifican as proteínas maior e menor da cápside viral, respectivamente. Ás veces utilízanse sitios de clonación múltiples para asegurar que os fragmentos son inseridos en cada un dos tres posibles marcos de lectura para que o fragmento de ADNc sexa traducido no marco axeitado. O xene do fago e o ADN híbrido a inserir é despois inserido (un proceso chamado "transdución") en células da bacteria Escherichia coli como as TG1, SS320, ER2738, ou XL1-Blue de E. coli. Se se utiliza un vector "faxémido" as partículas de fago non serán liberadas das células de E. coli ata que sexan infectadas polo fago axudante, o cal permite o empaquetamento do ADN do fago e a ensamblaxe dos virións maduros co fragmento proteico relevante como parte das súas cubertas externas sobre a proteína da cuberta menor (pIII) ou sobre a maior (pVIII). Ao inmobilizar unhas dianas proteicas ou ADN relevante na superficie dun pozo de placa microtituladora, un fago que exhiba a proteína que se une a unha daquelas dianas na súa superficie permanecerá mentres que outros son eliminados por lavado. Aqueles que permanecen poden ser eluídos, e usados para producir máis fagos (por infección bacteriana polo fago axudante) e para producir unha mestura de fagos que é enriquecida con fagos relevantes (é dicir, que se unen). O ciclo repetido destes pasos é denominado 'cribado', por analoxía co procedemento de enriquecemento dunha mostra de ouro ao eliminar materiais indesexables. O fago eluído no paso final pode ser utilizado para infectar un hóspede bacteriano axeitado, a partir do cal poden recollerse os faxémidos e as secuencias de ADN relevantes escindidas e secuenciadas para identificar as proteínas interaccionantes relevantes ou fragmentos proteicos.
O uso dun fago axudante pode ser eliminado usando a tecnoloxía de 'liña celular de empaquetamento bacteriano'.
A elución pode facerse combinando un tampón de elución de baixo pH con sonificación, que, ademais de debilitar a interacción péptido-diana, tamén serve para separar a molécula diana da superficie de inmobilización. Este método baseado en ultrasóns permite a selección nun só paso dun péptido de alta afinidade.
Aplicacións
As aplicacións da tecnoloxía do phage display inclúen a determinación de moléculas que interaccionan cunha proteína (que serían utilizadas como un "isco" de fago inmobilizado para unha biblioteca de ADN que consta de todas as secuencias codificantes dunha célula, tecido ou organismo) para que se poida determinar a función ou o mecanismo da función desa proteína. O phage display é tamén un método amplamente utilizado para a evolución de proteínas in vitro (tamén chamado enxeñaría de proteínas). A phage display é unha ferramenta útil no descubrimento de fármacos. Utilízase para atopar novos ligandos (inhibidores encimáticos, agonistas e antagonistas receptores) de proteínas diana. A técnica é tamén usada para determinar antíxenos tumorais (para o seu uso en diagnóstico e terapéutica) e na busca de interaccións proteína-ADN usando bibliotecas de ADN especialmente construídas con segmentos aleatorizados. Recentemente, o phage display foi tamén utilizado no contexto do tratamento do cancro, como na estratexia de transferencia de célula adoptiva. Nestes casos, o phage display utilízase para crear e seleccionar anticorpos sintéticos que teñen como diana proteínas da superficie do tumor. Estes son transformados en receptores sintéticos para células T recollidas de pacientes, que son usados para combater a enfermidade.
Entre os métodos en competencia para estudar a evolución proteica in vitro están o yeast display, bacterial display, ribosome display e mRNA display.
Maduración de anticorpos in vitro
A invención do phage display de anticorpos revolucionou o descubrimento de fármacos de tipo anticorpo. O traballo inicial fíxose nos laboratorios do Laboratorio de Bioloxía Molecular do MRC (Greg Winter e John McCafferty), o Instituto de Investigador Scripps (Richard Lerner e Carlos F. Barbas) e o Centro de Investigación do Cancro de Alemaña (Frank Breitling e Stefan Dübel). En 1991, o grupo Scripps informou do primeiro display e selección de anticorpos humanos en fagos. Este estudo inicial describiu o illamento rápido de Fab de anticorpo humano que se unen á toxina tetánica e o método foi despois ampliado para clonar rapidamente os anticorpos humanos anti-VIH-1 para o deseño de vacinas e terapias.
A phage display de bibliotecas de anticorpos converteuse nun poderoso método para estudar a resposta inmunitaria así como un método para seleccionar rapidamente e facer evolucionar anticorpos humanos para terapia. A phage display de anticorpos foi despois utilizada por Carlos F. Barbas no Instituto de Investigación Scripps para crear bibliotecas de anticorpos humanos sintéticos, un principio que foi patentado en 1990 por Breitling e colaboradores (Patente CA 2035384), que permitía a creación de anticorpos humanos in vitro a partir de elementos de diversidade sintéticos.
As bibliotecas de anticorpos que exhiben millóns de anticorpos diferentes en fagos son utilizadas a miúdo na industria farmacéutica para illar anticorpos terapéuticos altamente específicos, para desenvolvelos como fármacos de tipo anticorpo principalmente para a terapéutica anticancro ou antiinflamatoria. Un dos máis exitosos foi adalimumab, descuberto por Cambridge Antibody Technology como D2E7 e desenvolvido e comercializado por Abbott Laboratories. Adalimumab, un anticorpo para o TNF alfa, foi o primeiro anticorpo completamente humano no mundo que conseguiu vendas anuais de máis de mil millóns de dólares.
Protocolo xeral
A seguinte é a secuencia de eventos que hai que seguir nos exames de phage display para identificar polipéptidos que se unen con alta afinidade ás proteínas diana desexadas ou secuencias de ADN: As proteínas diana ou secuencias de ADN son inmobilizadas en pozos dunha placa microtitradora. Moitas secuencias xenéticas son expresadas nunha bblioteca de bacteriófagos en forma de fusións coa proteína de cuberta do bacteriófago, de modo que son exhibidas sobre a superficie da partícula viral. A proteína exhibida corresponde á secuencia xenética dentro do fago. Esta biblioteca de phage display engádese á placa e despois dáselle tempo ao fago para que se una antes de lavar a placa. As proteínas exhibidas polo fago que interaccionan coas moléculas diana permanecen unidas á placa, mentres que outras son retiradas polo lavado. O fago unido pode ser eluídas e utilízanse para crear máis fagos por infección de hóspedes bacterianos axeitados. O novo fago constitúe unha mestura enriquecida, que contén un fago considerablemente menos irrelevante (é dicir, que non se une) que os que estaban presentes na mestura inicial. Os pasos 3 a 6 están repetidos opcionalmente unha ou máis veces, enriquecendo máis a biblioteca de fagos en proteínas que se unen. Facendo máis amplificación baseada en bacterias, o ADN dentro do fago interaccionanate é secuenciado para identificar as proteínas interaccionantes ou fragmentos proteicos.
Selección da proteína da cuberta
Fagos filamentosos
pIII
A pIII é a proteína que determina a infectividade do virión. A pIII está composta de tres dominios (N1, N2 e CT) conectados por tramos espazadores ricos en glicina. O dominio N2 únese ao pilus F durante a infección do virión liberando o dominio N1, que despois interacciona cunha proteína TolA na superficie da bacteria. As insercións con esta proteína engádense usualmente á posición 249 (dentro dunha rexión espazadora entre CT e N2), á posición 198 (dentro do dominio N2) e no N-terminal (inseridos entre a secuencia de secreción N-terminal e o N-terminal de pIII). Porén, cando se usa o sitio de BamHI localizado na posición 198 débese ser coidadoso co residuo de cisteína desapareada (C201) que podería causar problemas durante a phage display se se está a usar unha versión non truncada de pIII.
Unha vantaxe de usar pIII en vez de pVIII é que pIII permite o display monovalente cando se usa un faxémido (plásmido derivado do fago Ff) combinado cun fago axudante. Ademais, o pIII permite a inserción de secuencias de proteína máis longas (de >100 aminoácidos) e é máis tolerante a el que pVIII. Porén, usar pIII como compañeiro de fusión pode causar un decrecemento na infectividade do fago, o que orixina problemas como un nesgo de selección causado pola diferenza na taxa de crecemento do fago ou aínda peor, a incapacidade do fago de infectar o seu hóspede. A perda da infectividade do fago pode evitarse usando un plásmido faxémido e un fago axudante para que o fago resultante conteña tanto o tipo silvestre coma o pIII fusión.
O ADNc foi tamén analizado usando pIII por medio de estrfatexias como dous sistemas de cremalleira de leucina complementarios, o Rescate de Interacción Directa ou a adición dun espazador de 8 a 10 aminoácidos entre o ADNc e pIII no C-terminal.
pVIII