La hibridación genómica comparativa o CGH (por sus siglas en inglés Comparative Genomic Hybridization) es un método de citogenética molecular para analizar las variaciones en el número de copias (CNV) en relación con el nivel de ploidía del ADN de una muestra en comparación con una muestra de referencia, esto sin la necesidad de realizar un cultivo celular. El objetivo de esta técnica es comparar de manera rápida y eficiente dos muestras de ADN genómico derivado de dos organismos diferentes, que a menudo se relacionan pues se sospecha que tienen diferencias ya sea en la ganancia o pérdida de cromosomas completos o regiones subcromosomales (una porción del cromosoma). Esta técnica originalmente se desarrolló para evaluar las diferencias entre los complementos cromosómicos de un tumor sólido y el tejido normal y tiene una resolución mejorada de 5-10 megabases en comparación con las técnicas tradicionales de análisis citogenéticos de banda como giemsa y FISH, las cuales están limitadas por la resolución del microscopio utilizado.Strachan T, Read AP (2010) Human Molecular Genetics: Garland Science.Weiss M, Hermsen M, Meijer G, Van Grieken N, Baak J, Kuipers E, Van Diest P (1999) Comparative genomic hybridization. Molecular Pathology 52:243-251.

Esto se logra con el uso de la hibridación competitiva fluorescente in situ. En resumen, implica el aislamiento de ADN de las dos fuentes a comparar, comúnmente la referencia y una muestra, el etiquetado independiente de cada muestra de ADN con diferentes fluoróforos (moléculas fluorescentes) de distintos colores (generalmente rojo y verde), la desnaturalización del ADN para volverlo monocatenario y la hibridación de las dos muestras resultantes en una proporción de 1:1 para una propagación normal de cromosomas en metafase, a los cuales las muestras de ADN marcadas se unirán en su locus de origen. A continuación, las señales fluorescentes de colores se comparan con el uso de un microscopio de fluorescencia y un software, esto a la longitud de onda de cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos muestras. Una mayor intensidad de color proveniente de la muestra de prueba en una región específica de un cromosoma indica la ganancia de material en esa región, mientras que una mayor intensidad de color de la muestra de referencia indica la pérdida de material en la muestra de ensayo en una región específica. Un color neutro (amarillo cuando las etiquetas de fluoróforos son de color rojo y verde) indica que no hay diferencia entre las dos muestras en esa región.

Esta técnica solo puede detectar anormalidades cromosómicas no balanceadas, debido a que las anomalías cromosómicas equilibradas como lo son las translocaciones recíprocas, las inversiones o los cromosomas anillo no afectan el número de copias, que es lo que se detecta por medio de la tecnología CGH. Sin embargo, el CGH permite la exploración de los 46 cromosomas humanos en una sola prueba y la detección de deleciones y duplicaciones, en escala microscópica lo que puede conducir a la identificación de genes candidatos para estudiarlos más a fondo mediante otras técnicas citológicas.

Mediante el uso de microarreglos de ADN en conjunto con la técnica de CGH, se desarrolló un arreglo más específico (aCGH), que permite medir la variación del número de copias locus por locus con una resolución mayor como lo son 100 kilobases.Pinkel D, Albertson DG (2005) Comparative genomic hybridization. Annu Rev Genomics Hum Genet 6:331-354.de Ravel TJ, Devriendt K, Fryns J-P, Vermeesch JR (2007) What’s new in karyotyping? The move towards array comparative genomic hybridization (CGH). European journal of pediatrics 166:637-643. Esta técnica mejorada permite descubrir la etiología de condiciones conocidas y desconocidas.

Historia La motivación para el desarrollo de la CGH deriva del hecho de que las formas disponibles de análisis citogenético de bandeo en el momento (Giemsa y FISH) estaban limitadas en su potencial de resolución por los microscopios necesarios para la interpretación de los resultados. Además, la interpretación de bandas giemsa suele ser ambiguo y por lo tanto su fiabilidad es baja, estas técnicas requieren bastante mano de obra lo que limita los loci a examinar.

En 1992 Kallioniemi y sus colegas reportaron el primer análisis de CGH en la Universidad de California, en San Francisco, quienes utilizaron tumores sólidos en su análisis. Lograron esto a través de la aplicación directa de la técnica a las dos líneas celulares de cáncer de mama y tumores vesicales primarios con el fin de establecer el número completo de copias de los cariotipos para las células. Fueron capaces de identificar 16 regiones de amplificación diferentes, muchas de las cuales fueron descubrimientos nuevos.Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar Da, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D (1992) Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 258:818-821.

Poco después, du Manoir et al. reportaron prácticamente la misma metodología. Los autores tiñeron una serie de cromosomas humanos a partir de una biblioteca de ADN con dos fluoróforos diferentes que estaban en proporciones distintas y de esta manera pusieron a prueba la técnica, también aplicaron CGH al ADN genómico de pacientes con Síndrome de Down o con leucemia prolinfocítica de células T, así como células de una línea celular de carcinoma papilar renal. Se concluyó que los coeficientes de fluorescencia obtenidos fueron exactos y que las diferencias entre el ADN genómico a partir de diferentes tipos de células fueron detectables y, por lo tanto, que CGH era una herramienta de análisis citogenético de gran utilidad.du Manoir S, Speicher MR, Joos S, Schröck E, Popp S, Döhner H, Kovacs G, Robert-Nicoud M, Lichter P, Cremer T (1993) Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic in situ hybridization. Human genetics 90:590-610.

Inicialmente, el uso generalizado de la tecnología CGH fue complicado, ya que los protocolos no estaban estandarizados y por lo tanto surgieron inconsistencias, sobre todo debido a las incertidumbres en la interpretación de los datos. Sin embargo, en 1994 se publicó una revisión en la cual se describía de manera sencilla y detallada el protocolos,Solinas‐Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A, Döhner H, Cremer T, Lichter P (1997) Matrix‐based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalances. Genes, Chromosomes and Cancer 20:399-407. y se comercializó el software de análisis de imágenes, lo que permitió que CGH se utilizara en todo el mundo. Ya que nuevas técnicas como la microdisección y la reacción en cadena de polimerasa de oligonucleótidos degradados (DOP-PCR), fue posible aplicar el concepto de CGH a anormalidades cromosómicas más pequeñas y, por lo tanto, mejorar la resolución de CGH.

La implementación de los arreglos de CGH, donde se utilizan microarreglos de ADN en lugar de preparaciones tradicionales de cromosomas en metafase, fue iniciada por Toledo et al. en 1997 con células tumoralesSolinas‐Toldo S, Lampel S, Stilgenbauer S, Nickolenko J, Benner A, Döhner H, Cremer T, Lichter P (1997) Matrix‐based comparative genomic hybridization: biochips to screen for genomic imbalances. Genes, Chromosomes and Cancer 20:399-407. y en 1998 por Pinkel et al. mediante el uso de células de cáncer de mama.Pinkel D, Segraves R, Sudar D, Clark S, Poole I, Kowbel D, Collins C, Kuo W-L, Chen C, Zhai Y (1998) High resolution analysis of DNA copy number variation using comparative genomic hybridization to microarrays. Nature genetics 20:207-211. Esto fue posible gracias al Proyecto del Genoma Humano, pues se generó una biblioteca de fragmentos de ADN clonados que tenían ubicaciones conocidas en todo el genoma humano, estos fragmentos se utilizan como sondas en el micro-arreglo de ADN.Marquis-Nicholson R, Aftimos S, Hayes I, George A, Love DR (2010) Array comparative genomic hybridization: a new tool in the diagnostic genetic armoury. NZ Med J 123:50-61. Ahora sondas de diversos orígenes tales como ADNc, productos de PCR genómica y cromosomas artificiales bacterianos (BAC) pueden utilizarse en micromatrices de ADN, que pueden contener hasta 2 millones de sondas. El arreglo de CGH es automático y permite una mayor resolución (hasta 100 kb) que CGH tradicional ya que las sondas son más pequeñas y así se pueden dirigir a regiones cromosómicas específicas si es necesario, por lo tanto el análisis es más rápido y mucho más adaptable a su uso en el diagnóstico.Inazawa J, Inoue J, Imoto I (2004) Comparative genomic hybridization (CGH)‐arrays pave the way for identification of novel cancer‐related genes. Cancer Science 95:559-563.

Métodos básicos

Preparación de láminas en metafase (la metafase es una de las etapas de la mitosis y la meiosis, que son los dos tipos de división celular) El ADN en la lámina es una muestra de referencia, y se obtiene de un hombre o una mujer cariotípicamente normal, aunque es preferente utilizar ADN femenino, ya que posee dos cromosomas X los cuales contienen más información genética que el cromosoma masculino Y. Se utiliza fitohemaglutinina de linfocitos de sangre periférica. Se añade 1 ml de sangre heparinizada a 10 ml de medio de cultivo y se incuba durante 72 horas a 37 °C en una atmósfera de 5% CO2, además se agregó colchicina para detener la mitosis en las células, estas se recuperan y tratan con solución hipotónica de cloruro de potasio y se fijaron en metanol y ácido acético a 3:1.

Una gota de la suspensión de células debe dejarse caer sobre una lámina limpiada con etanol desde una altura de aproximadamente 30 cm, esto debe llevarse a cabo a temperatura ambiente y con un 60-70% de humedad. Las láminas deben evaluarse de manera visual utilizando un microscopio de contraste de fase, se debe observar muy poco citoplasma y los cromosomas no deben estar encimados y medir de 400 a 550 bandas sin cromátidas separadas, para que al final se observen obscuros en lugar de brillantes. Después, las láminas deben secarse con aire durante la noche a temperatura ambiente, y cualquier almacenamiento necesario se debe hacer en grupos de cuatro a -20 °C, ya sea con perlas de sílice o con nitrógeno, para así lograr mantenerlas secas. Varios donadores deben ser analizados pues la hibridación puede ser variable. Hay una disposición de láminas comerciales, pero deben ser testadas antes.

Aislamiento de ADN a partir de un tejido de prueba y uno de referencia Se utiliza la extracción de fenol estándar para obtener el ADN de ambas muestras de tejido (de un individuo cariotípicamente normal), lo que implica la combinación del buffer Tris y el fenol con el ADN acuoso en cantidades iguales. Enseguida se realiza una separación por agitación y una centrifugación, después de lo cual se elimina el sobrenadante (capa acuosa), adicionalmente se trata con éter y, finalmente, se utiliza precipitación con etanol para concentrar el ADN.

Este proceso se puede completar con kits de aislamiento de ADN que están disponibles comercialmente y se basan en columnas de afinidad.

Preferentemente, el ADN debe extraerse de tejidos fríos o congelados, ya que esto permitirá que tenga una más ata calidad, a pesar de que ahora es posible utilizar material de archivo, que está incrustado en formol o cera de parafina, siempre que se sigan los procedimientos adecuados. Aproximadamente, 0.5-1 μg de ADN es suficiente para el análisis de CGH, aunque si no se obtiene la cantidad deseada se puede aplicar DOP-PCR para amplificar el ADN, sin embargo, en este caso, es importante aplicar DOP-PCR tanto a la prueba como a las muestras de ADN de referencia para una mayor fiabilidad.

Marcaje de ADN

Sondas y marcado

La sonda es un fragmento específico de ADN (o ARN), radiactivo, capaz de reconocer una secuencia

complementario de ADN o ARN en una población de muchos fragmentos.