La síntesis artificial de genes, o simplemente síntesis de genes, se refiere a un grupo de métodos que se usan en biología sintética para construir y ensamblar genes a partir de nucleótidos de novo. A diferencia de la síntesis de ADN en células vivas, la síntesis artificial de genes no requiere ADN molde, lo que permite sintetizar prácticamente cualquier secuencia de ADN en el laboratorio. Comprende dos pasos principales, el primero de los cuales es la síntesis de ADN en fase sólida, a veces conocida como impresión de ADN. Esto produce fragmentos de oligonucleótidos que generalmente tienen menos de 200 pares de bases. La segunda etapa implica entonces conectar estos fragmentos de oligonucleótidos usando varios métodos de ensamblaje de ADN. Debido a que la síntesis artificial de genes no requiere ADN molde, en teoría es posible fabricar una molécula de ADN completamente sintética sin límites en la secuencia de nucleótidos o el tamaño.
La síntesis del primer gen completo, un ARNt de levadura, fue demostrada por Har Gobind Khorana y colaboradores en 1972. La síntesis de los primeros genes codificantes de péptidos y proteínas se realizó en los laboratorios de Herbert Boyer y Alexander Markham, respectivamente. Más recientemente, se han desarrollado métodos artificiales de síntesis de genes que permitirán el ensamblaje de cromosomas y genomas completos. El primer cromosoma sintético de levadura se sintetizó en 2014, y también se han sintetizado cromosomas bacterianos funcionales completos. Además, la síntesis artificial de genes podría hacer uso en el futuro de nuevos pares de nucleobases (pares de bases no naturales).
Métodos estándar para la síntesis de ADN
Síntesis de oligonucleótidos Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando componentes básicos llamados nucleósidos fosforamiditos. Estos pueden ser nucleósidos normales o modificados que tienen grupos protectores para evitar que sus aminas, grupos hidroxilo y grupos fosfato interactúen incorrectamente. Se agrega una fosforamidita a la vez, se desprotege el grupo hidroxilo 5' y se agrega una nueva base, y así sucesivamente. La cadena crece en la dirección 3' a 5' , que es hacia atrás en relación con la biosíntesis. Al final, se eliminan todos los grupos protectores. Sin embargo, al tratarse de un proceso químico, se producen varias interacciones incorrectas que dan lugar a algunos productos defectuosos. Cuanto más larga es la secuencia de oligonucleótidos que se está sintetizando, más defectos hay, por lo que este proceso solo es práctico para producir secuencias cortas de nucleótidos. El límite práctico actual es de aproximadamente 200 pb (pares de bases) para un oligonucleótido con calidad suficiente para usarse directamente para una aplicación biológica. La HPLC se puede usar para aislar productos con la secuencia adecuada. Mientras tanto, se puede sintetizar una gran cantidad de oligos en paralelo en chips genéticos. Para un rendimiento óptimo en procedimientos de síntesis génica posteriores, deben prepararse individualmente y a mayor escala.
Conexión basada en hibridación de oligonucleótidos Normalmente, se elabora un conjunto de oligonucleótidos diseñados individualmente en sintetizadores automáticos de fase sólida, se purifican y luego se conectan mediante hibridación específica y ligación estándar o reacciones de polimerasa. Para mejorar la especificidad de la hibridación de oligonucleótidos, la etapa de síntesis se basa en un conjunto de enzimas ADN ligasa y polimerasa termoestables. Hasta la fecha, se han descrito varios métodos para la síntesis génica, como la ligación de oligonucleótidos solapantes fosforilados,el método Fok I y una forma modificada de reacción en cadena de la ligasa para la síntesis génica. Además, se han descrito varios enfoques de ensamblaje de PCR. Usualmente emplean oligonucleótidos de 40-50 nucleótidos de longitud que se superponen entre sí. Estos oligonucleótidos están diseñados para cubrir la mayor parte de la secuencia de ambas cadenas, y la molécula de longitud completa se genera progresivamente mediante PCR de extensión superpuesta (OE), PCR termodinámicamente equilibrada de adentro hacia afuera (TBIO) o enfoques combinados. Los genes sintetizados más comúnmente varían en tamaño de 600 a 1200 pb, aunque se han creado genes mucho más largos conectando fragmentos ensamblados previamente de menos de 1000 pb. En este intervalo de tamaños, es necesario ensayar varios clones candidatos, confirmando la secuencia del gen sintético clonado mediante métodos de secuenciación automatizados.
Limitaciones Además, debido a que el ensamblaje del producto génico de longitud completa se basa en el alineamiento eficiente y específico de oligonucleótidos monocatenarios largos, los parámetros críticos para el éxito de la síntesis incluyen regiones de secuencia extendida que comprenden estructuras secundarias causadas por repeticiones invertidas, contenido de GC extraordinariamente alto o bajo o estructuras repetitivas. Por lo general, estos segmentos de un gen en particular solo se pueden sintetizar dividiendo el procedimiento en varios pasos consecutivos y un ensamblaje final de subsecuencias más cortas, lo que a su vez conduce a un aumento significativo en el tiempo y la mano de obra necesarios para su producción. El resultado de un experimento de síntesis génica depende en gran medida de la calidad de los oligonucleótidos utilizados. Para estos protocolos de síntesis génica basados en hibridación, la calidad del producto depende directa y exponencialmente de la corrección de los oligonucleótidos empleados. Alternativamente, después de realizar la síntesis génica con oligos de menor calidad, se debe hacer más esfuerzo en la garantía de calidad aguas abajo durante el análisis de clones, lo que generalmente se realiza mediante procedimientos estándar de clonación y secuenciación que consumen mucho tiempo. Otro problema asociado con todos los métodos de síntesis génica actuales es la alta frecuencia de errores de secuencia debido al uso de oligonucleótidos sintetizados químicamente. La frecuencia de error aumenta con oligonucleótidos más largos y, como consecuencia, el porcentaje de producto correcto disminuye drásticamente a medida que se usan más oligonucleótidos. El problema de la mutación podría resolverse mediante el uso de oligonucleótidos más cortos utilizados para ensamblar el gen. Sin embargo, todos los métodos de ensamblaje basados en recocido requieren que los cebadores se mezclen juntos en un tubo. En este caso, los solapamientos más cortos no siempre permiten una hibridación precisa de cebadores complementarios, lo que da como resultado la inhibición de la formación de productos de longitud completa. El diseño manual de oligonucleótidos es un procedimiento laborioso y no garantiza la síntesis exitosa del gen deseado. Para un rendimiento óptimo de casi todos los métodos basados en hibridación, se supone que las temperaturas de fusión de las regiones superpuestas son similares para todos los oligonucleótidos. La optimización necesaria del cebador debe realizarse usando programas especializados de diseño de oligonucleótidos. Hasta ahora se han presentado varias soluciones para el diseño automatizado de cebadores para la síntesis génica.
Procedimientos de corrección de errores Para superar los problemas asociados con la calidad de los oligonucleótidos, se han desarrollado varias estrategias elaboradas, empleando oligonucleótidos pesqueros preparados por separado enzimas de unión a desajustes de la familia mutS o endonucleasas específicas de bacterias o fagos. Sin embargo, todas estas estrategias aumentan el tiempo y el costo de la síntesis génica basada en la hibridación de oligonucleótidos sintetizados químicamente.
La secuenciación masiva en paralelo también se ha utilizado para seleccionar bibliotecas complejas de oligonucleótidos y recuperar moléculas precisas. En un enfoque, los oligonucleótidos se secuencian en la plataforma de pirosecuenciación 454 y un sistema robótico toma imágenes y recoge perlas individuales correspondientes a la secuencia precisa. En otro enfoque, una biblioteca compleja de oligonucleótidos se modifica con etiquetas flanqueantes únicas antes de la secuenciación masiva en paralelo. Los cebadores dirigidos por etiquetas permiten luego la recuperación de moléculas con las secuencias deseadas mediante PCR de marcación.
Cada vez más, los genes se ordenan en conjuntos que incluyen genes funcionalmente relacionados o múltiples variantes de secuencia en un solo gen. Prácticamente todas las proteínas terapéuticas en desarrollo, como los anticuerpos monoclonales, se optimizan probando muchas variantes genéticas para mejorar la función o expresión. La optimización de codones tiene aplicaciones en el diseño de genes sintéticos y vacunas de ADN. Las herramientas recientes incluyen modelos de aprendizaje automático como ColiFormer, que utilizan características de secuencia para guiar la optimización de codones; una implementación abierta está disponible como un Hugging Face Space.
Pares de bases antinaturales Mientras que la síntesis tradicional de ácidos nucleicos solo usa 4 pares de bases: adenina, timina, guanina y citosina, la síntesis de oligonucleótidos en el futuro podría incorporar el uso de pares de bases no naturales, que son nucleobases diseñadas y sintetizadas artificialmente que no ocurren en la naturaleza.
En 2012, un grupo de científicos estadounidenses dirigido por Floyd Romesberg, biólogo químico del Instituto de Investigación Scripps en San Diego, California, publicó que su equipo diseñó un par de bases antinatural (UBP). Los dos nuevos nucleótidos artificiales o Pares de Bases No Naturales (UBP) se denominaron d5SICS y dNaM. Más técnicamente, estos nucleótidos artificiales que portan nucleobases hidrófobas presentan dos anillos aromáticos fusionados que forman un complejo (d5SICS–dNaM) o un par de bases en el ADN. En 2014, el mismo equipo del Instituto de Investigación Scripps informó que sintetizaron un tramo de ADN circular conocido como plásmido que contenía pares de bases T-A y C-G naturales junto con el UBP de mejor rendimiento que había diseñado el laboratorio de Romesberg, y lo insertaron en células de la bacteria común E. coli que replicó con éxito los pares de bases antinaturales a través de múltiples generaciones. Este es el primer ejemplo conocido de un organismo vivo que transmite un código genético expandido a generaciones posteriores. Esto se logró en parte mediante la adición de un gen de algas de apoyo que expresa un transportador de trifosfato de nucleótidos, que importa eficientemente los trifosfatos tanto de d5SICSTP como de dNaMTP a la bacteria E. coli. Luego, las vías naturales de replicación bacteriana las usan para replicar con precisión el plásmido que contiene d5SICS-dNaM.
La incorporación exitosa de un tercer par de bases es un avance significativo hacia el objetivo de expandir en gran medida el número de aminoácidos que puede codificar el ADN, de los 20 aminoácidos existentes a los 172 teóricamente posibles, expandiendo así el potencial de los organismos vivos para producir nuevas proteínas. En el futuro, estos pares de bases antinaturales podrían sintetizarse e incorporarse en oligonucleótidos mediante métodos de impresión de ADN.
Ensamblaje de ADN