thumb|FISH metafásico en humanos. En amarillo, el cromosoma 2. FISH o hibridación fluorescente in situ es una técnica citogenética de marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten fluorescencia y permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas de núcleos en metafase o inferfase, así como de las anomalías que puedan presentar. Dicha técnica fue desarrollada por un equipo biomédico a principios de la década de 1980. Esta técnica permite la rápida determinación de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la adjudicación de un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética). Se realiza una tinción de DNA no específica con DAPI y se verá la fluorescencia bajo el microscopio.
Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que son los más propensos a sufrir anomalías. Están relacionados con enfermedades como el síndrome de Patau (13), el síndrome de Edwards (18), el síndrome de Down (21), el síndrome de Turner (X) y el síndrome del superhombre (Y), entre otros. Sin embargo, como son posibles marcados adicionales del cromosoma, otros cromosomas pueden ser visualizados con esta técnica. FISH usa segmentos de una única hebra de ADN que son tintados, o etiquetados, con una sustancia fluorescente que puede ligarse a un cromosoma específico; estos segmentos de ADN son llamados sondas. En un principio se empleaban sondas de carácter radiactivo, pero este tipo de marcaje fue reemplazado por los fluoróforos por mayor seguridad, eficacia y facilidad de detección.
thumb|FISH interfásico en ratón.
Protocolo básico
El primer paso de la técnica consiste en la desnaturalización del DNA para separar la doble hélice. A la muestra desnaturalizada se le añade entonces la sonda de interés (fragmento de ADN marcado fluorescentemente). Primero, las sondas hibridan a las regiones específicas para las que han sido diseñadas. Después, se tiñen los núcleos con un color de contraste inespecífico (generalmente DAPI). Las sondas de DNA pueden marcarse con moléculas fluorescentes denominados fluoróforos (método directo) o no fluorescentes que se detectan con anticuerpos fluorescentes (método indirecto). Por último, se visualiza la muestra preparada bajo un microscopio de fluorescencia.
FISH en metafase
Cuando las células están en metafase, sus cromosomas se encuentran condensados a modo de preparación para la división celular. Para detenerlas en metafase, se emplea colchicina, un agente despolimerizante de los microtúbulos encargado de separar las cromátidas hermanas de un cromosoma, impidiendo así el avance de la división celular. Este tipo de FISH se utiliza para detectar microdeleciones específicas, translocaciones o para identificar material extra de origen desconocido. Los tipos de sondas usadas son: Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se emplean en estudios de microdeleciones. Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de cromosomas marcadores. Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas zonas del cromosoma y así marcar el cromosoma completo. Se usan para ver translocaciones. En la imagen que acompaña el texto se muestra un ejemplo de uso de una sonda completa para el cromosoma 4, en el que destacan las dos copias de dicho cromosoma sobre el resto.
FISH en interfase
No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para realizar el FISH, y los resultados obtenidos no serán tan específicos. Sin embargo, el FISH en interfase tiene la ventaja de que no es necesario cultivar previamente las células durante diversos días antes de poder analizar sus cromosomas. Además, cuando las células se encuentran en interfase, la cromatina está en torno a 10 000 veces más descondensada que en metafase, lo cual permite una mayor resolución a la hora de detectar anomalías pequeñas. Se emplea sobre todo para la detección de aneuploidias o grandes deleciones, duplicaciones o traslocaciones cuando las muestras son difíciles de crecer o son escasas, es el caso de las células fetales o tumorales. No es posible distinguir entre un cariotipo normal y un cariotipo que presente una translocación equilibrada. Además, puede ser empleado en el análisis de tumores sólidos, que se dividen con muy poca frecuencia.
Esta técnica puede usarse también al realizar tratamientos de fecundación in vitro para detectar anormalidades en los cromosomas. Partiendo de las ocho células o blastómeros, se da la apertura de la zona pelúcida, y una sola célula se fijará sobre un soporte sólido para realizar el cariotipo (esta célula está en interfase). Las otras siete células, sin embargo, se dejan libres para que formen de nuevo el octavo blastómero y así generar el embrión que será implantado.
Una forma reciente derivada del FISH inverso son los arrays de CGH (del inglés "Comparative Genomic Hybridization"), que están desplazando a técnicas como FISH y el cariotipo.
Otras variantes de FISH
FISH en hebra Este tipo de FISH (también llamado "Fiber FISH" o "Halo FISH") se aplica sobre hebras de ADN desproteinizadas (es decir, desprovistas de las histonas encargadas de su compactación). Se extiende linealmente y de forma mecánica en un porta el fragmento de cromosoma a estudiar. Se observarán puntos discontinuos por rotura de la hebra de ADN. Esta técnica permite detectar pequeñas reorganizaciones porque admite una mayor resolución (permite incluso la visualización de genes individuales). La técnica puede ser usada para detectar deleciones en clones y para estimar huecos en los proyectos genoma.
FISH inverso Por su parte, el FISH inverso es una técnica que se usa mucho para determinar la procedencia de un cromosoma marcador. Este tipo de FISH tiene la peculiaridad de ser el ADN problema el que se marca. El procedimiento consiste en recortar un fragmento de cromosoma o dicho cromosoma marcador de un porta donde se encuentran todos los cromosomas fijados. Se encuentran teñidos con Giemsa o con una sonda, esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva sonda. A continuación, ponemos los cromosomas de un donante sin anomalías (generalmente procedente de sus linfocitos y de un varón para contemplar todas las opciones, es decir, tener los cromosomas X e Y) en un porta y añadimos la sonda preparada. Esperamos ver que hay hibridación de la sonda (cromosoma marcador) con alguno de los cromosomas del donante por complementariedad en su secuencia. Así, podemos determinar que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el que hibrida. Una vez identificado, el cromosoma marcador pasaría a ser llamado un cromosoma derivativo.
FISH on a chip
marco|right|Análisis de una muestra de sangre por la técnica FISH on chip: Se introduce la muestra de sangre en el chip por capilaridad. Se añade la proteína K para digerir las células y se desnaturaliza su ADN con calor. A continuación se introducen las sondas y se dejan hibridar con el ADN diana. Esta nueva variante de la técnica FISH, ha surgido como una forma de automatizar los estudios de muestras por el método convencional. Esta nueva técnica conlleva numerosas ventajas, como la necesidad de utilizar menor cantidad de reactivos, el empleo de un menor número tiempo de análisis (ya que en menos de una hora se pueden analizar los núcleos, frente a las 2-3 horas que precisa el procedimiento de FISH convencional).Los sistemas basados en chips microfluídicos evitan las dificultades de la muestra, ya que se trata de un método sencillo con un bajo coste y consumo de reactivos. Tampoco requieren ningún método de hilado. La preparación de muestras basada en chips miniaturiza toda la herramienta de laboratorio en un dispositivo único con un método de microfabricación y llega a sustituir el costoso equipo utilizado para el laboratorio biológico y el campo clínico. Esto conduce al desarrollo del autoanálisis casero.
La principal aplicación de este novedoso sistema es en el campo del diagnóstico clínico, sobre todo en el estudio de enfermedades neuronales, como es el caso de la enfermedad del Alzheimer en su estadio temprano, aunque no se descarta su uso en otros campos como en la industria alimentaria.
Se emplea un chip microfluídico con estrechos canales, por los que se hace pasar la suspensión celular purificada por capilaridad, lavada previamente con PBS. Una vez adheridas o fijadas las células a los canales por calor, digerimos las células mediante la adición de proteinasa K y desnaturalizamos su material genético, nuevamente por un incremento de temperatura. Tras estos pasos, ya pueden ser añadidas las sondas y reactivos necesarios, que difundirán a lo largo de todo el canal, pudiendo observar los núcleos bajo el microscopio en el mismo chip y de manera ordenada.
FISH on chip es una técnica muy útil para detectar anomalías cromosómicas (aneuploidías), entre otros defectos. En el caso del Alzheimer, es habitual utilizar muestras de linfocitos procedentes de sangre periférica, fibroblastos o muestras de orina.
FISH multicolor
El ‘’FISH Multicolor’’, ‘’M-FISH’’ o ‘’SKY’’ (Spectral Karyotiping) es una adaptación del FISH que permite la visualización de los 23 pares de cromosomas a la vez, teñidos con diferentes sondas fluorescentes.
A nivel comercial solo hay 5 colores distintos posibles, por lo que se puede usar la sonda de un color concreto o combinar dos tipos de sondas para crear un nuevo color. El sistema de detección del equipo empleado debe estar adaptado a los 5 colores. Un programa informático se encarga de analizar las imágenes y formar el cariograma: organiza los cromosomas de acuerdo a la emisión de las sondas que tiene integradas y las combina hasta dar las 23 combinaciones.
Se utiliza con frecuencia en el estudio de células tumorales. El poder de dicho método reside en su habilidad para: Determinar rápidamente si hay algún cromosoma adicional en el cariotipo y de qué cromosoma se trata, porque su color permitirá identificarlo. Determinar si está presente algún cromosoma translocado y qué cromosomas están implicados en la translocación por la combinación de dos colores asociados a cromosomas diferentes en un mismo cromosoma. Rápida identificación de material cromosómico de un cromosoma que haya sido insertado en otro cromosoma por la variación del color del fragmento insertado respecto al color de todo el cromosoma. Identificación de cromosomas pequeños o fragmentados que frecuentemente implican el problema de averiguar su origen, como es el caso de los cromosomas marcadores.
Estas aplicaciones del SKY se deben a que cada cromosoma está teñido completamente de un único color (de una única sonda) y por eso, viendo el color que van a tener todos los cromosomas de la muestra podemos saber que anomalía presenta el paciente.
Sin embargo, aunque se pensaba que iba a desbancar al cariotipo tradicional, tiene una serie de desventajas que han frenado su uso, especialmente el uso clínico. Estas son: El elevado precio. Menor definición que el FISH convencional. Solo se pueden ver cromosomas y traslocaciones grandes, sin poder observar bandas.
Tipos de sondas FISH Sondas centroméricas Consisten en secuencias de ADN repetitivas encontradas alrededor del centrómero de un cromosoma específico. Utilizadas para el diagnóstico de aneuploudías como las trisomías 13, 18, 21.
Sondas de secuencia única específicas de un cromosoma Son específicas de un locus único en concreto. Se usan para proporcionar un diagnóstico prenatal rápido de algunas anomalías cromosómicas numéricas habituales. Sondas teloméricas Se ha desarrollado un juego completo de este tipo de sondas para los 24 cromosomas. Su uso es útil para identificar diminutas anomalías.