La proteómica top-down es un método de identificación de proteínas que emplea un espectrómetro de masas con trampa iónica para almacenar un ion proteico aislado para la medición de masa y el análisis por espectrometría de masas en tándem (MS/MS) u otros métodos de purificación de proteínas como la electroforesis bidimensional en conjunto con MS/MS. La proteómica top-down permite identificar y cuantificar proteoformas únicas mediante el análisis de proteínas intactas. Su nombre se deriva del enfoque similar a la secuenciación de ADN. Durante la espectrometría de masas, las proteínas intactas suelen ionizarse mediante ionización por electrospray y se atrapan en una resonancia ciclotrónica de iones de transformada de Fourier (trampa de Penning), una trampa de iones cuadrupolo (trampa de Paul) Orbitrap. La fragmentación para espectrometría de masas en tándem se logra mediante disociación por captura de electrones o disociación por transferencia de electrones. El fraccionamiento eficaz es fundamental para el manejo de muestras antes de la proteómica basada en espectrometría de masas. Analizar el proteoma incluye la difestión rutinaria de proteínas intactas seguido de la identificación de proteínas inferidas mediante espectrometría de masas (MS). En la proteómica top-down (sin gel), la estructura de las proteínas se estudia midiendo su masa intacta y luego fragmentando directamente los iones en fase gaseosa para obtener información estructural detallada.
Permite detectar productos de degradación, isoformas de proteínas, variantes de secuencia y combinaciones de modificaciones postraduccionales con alta resolución, además de simplificar los procesos de normalización de datos y cuantificación. Si se acompaña con electroforesis en gel de poliacrilamida, la proteómica top-down puede complementar el enfoque bottom-up. Los métodos top-down pueden revelar desviaciones significativas respecto a predicciones basadas en digestión peptídica. Para proteínas pequeñas, la proteómica bottom-up puede tener dificultades al no generar suficientes péptidos, el enfoque top-down facilita la detección de proteínas de bajo peso molecular, ampliando el repertorio de proteínas estudiables. A diferencia del enfoque bottom-up, que integra productos peptídicos de todas las proteoformas generadas por un gen en un mapa peptídico único, la estrategia top-down permite seguir cuantitativamente una o más proteoformas entre múltiples muestras y aislar esas proteoformas para análisis químicos.
En el pasado, el enfoque top-down estaba restringido al análisis de proteínas individuales o mezclas simples, mientras que las mezclas complejas se investigaban con métodos bottom-up. La identificación de proteínas y caracterización de proteoformas en el enfoque top-down puede enfrentar un problema de rango dinámico, donde las especies más abundantes se fragmentan repetidamente. Aunque la proteómica top-down puede operar con una salida relativamente alta para mapear el proteoma, la tasa de identificación de nuevas proteínas decrece rápidamente tras las primeras rondas. La implementación a gran escala está limitada por la falta de métodos de fraccionación de proteínas intactas integrados con espectrometría de masas en tándem.
Estudio uno: Cuantificación e identificación de miles de proteoformas humanas por debajo de 30 kDa
Los investigadores realizaron un estudio sobre proteoformas humanas con masas inferiores a 30 kDa, utilizando fibroblastos humanos IMR90 primarios que contenían un constructo funcional de Ras y fueron cultivados en medio controlado. Eligieron aplicar la proteómica top-down para caracterizar estas proteoformas, ya que actualmente es el método más eficaz para el análisis de proteínas intactas. A diferencia de la estrategia bottom-up, que implica la digestión de las proteínas en péptidos, el enfoque top-down permite observar las proteoformas completas y distinguir variantes estructurales que de otro modo se perderían durante la fragmentación. Mediante este método, los investigadores lograron identificar y cuantificar proteoformas únicas a partir del análisis directo de proteínas intactas. El estudio de cuantificación top-down reveló cambios en la abundancia de 1 038 proteoformas citoplasmáticas.
Estudio dos: Combinación de espectrometría de masas MALDI-TOF de alto rendimiento y electroforesis en gel con enfoque isoeléctrico para la proteómica virtual 2D basada en gel
Los investigadores utilizaron la proteómica top-down porque les permitió identificar las proteoformas exactas de las proteínas intactas, a diferencia del enfoque bottom-up, que solo genera iones fragmentados de péptidos. En este estudio se empleó una metodología denominada “gel virtual 2D” en combinación con espectrometría de masas para separar mezclas complejas de proteínas. El análisis se realizó mediante la técnica MALDI, un software computacional que genera las masas intactas de las proteínas en cada punto isoeléctrico. El proceso comenzaba con la imagen de un gel de enfoque isoeléctrico con gradiente inmovilizado (IPG-IEF), cuya región seleccionada era posteriormente analizada por MALDI. La proteómica top-down basada en MALDI-TOF/TOF-MS presenta varias ventajas: es más tolerante a impurezas, no requiere extracción, purificación ni separación de biomarcadores, y puede aplicarse directamente a microorganismos intactos.
Espectrometría de masas de proteínas Proteómica de abajo hacia arriba Proteómica de escopeta Espectrometría de masas en tándem (MS/MS)
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