miniaturadeimagen|Imagen digital de 3 digestiones de restricción de plásmidos en un gel de agarosa al 1% p/v, 3 voltios/cm, teñido con bromuro de etidio. El marcador de tamaño de ADN es una escalera comercial de 1 kbp. Se indica la posición de los pocillos y la dirección de migración del ADN. La electroforesis en gel de agarosa es un método de electroforesis en gel utilizado en bioquímica, biología molecular, genética y química clínica para separar una población mixta de macromoléculas, como ADN o proteínas, en una matriz de agarosa, uno de los dos componentes principales del agar. Las proteínas pueden separarse por carga y/o tamaño (la electroforesis de agarosa con enfoque isoeléctrico es esencialmente independiente del tamaño), y los fragmentos de ADN y ARN por longitud. Las biomoléculas se separan aplicando un campo eléctrico para mover las moléculas cargadas a través de una matriz de agarosa, y las biomoléculas se separan por tamaño en la matriz de gel de agarosa.

El gel de agarosa es fácil de moldear, tiene relativamente menos grupos cargados y es especialmente adecuado para separar ADN del rango de tamaños más frecuente en los laboratorios, lo que explica la popularidad de su uso. El ADN separado puede visualizarse con tinción, normalmente bajo luz ultravioleta, y los fragmentos de ADN pueden extraerse del gel con relativa facilidad. La mayoría de los geles de agarosa utilizados se disuelven entre el 0,7 y el 2% en un tampón de electroforesis adecuado.

Propiedades del gel de agarosa El gel de agarosa es una matriz tridimensional formada por moléculas helicoidales de agarosa en haces superenrollados que se agregan en estructuras tridimensionales con canales y poros a través de los cuales pueden pasar las biomoléculas. La estructura tridimensional se mantiene unida mediante enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, puede romperse calentándola hasta que vuelva a su estado líquido. La temperatura de fusión es diferente de la temperatura de gelificación, dependiendo de las fuentes, el gel de agarosa tiene una temperatura de gelificación de 35-42 °C y una temperatura de fusión de 85-95 °C. También existen agarosas de baja fusión y baja gelificación fabricadas mediante modificaciones químicas.

El gel de agarosa tiene un gran tamaño de poro y una buena resistencia de gel, lo que lo hace adecuado como medio anticonvección para la electroforesis de ADN y grandes moléculas de proteínas. El tamaño de poro de un gel al 1% se ha estimado entre 100 nm y 200-500 nm, y su fuerza de gel permite que geles tan diluidos como el 0,15% formen una losa para electroforesis en gel. Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1-0,2%) son frágiles y, por tanto, difíciles de manipular. El gel de agarosa tiene un menor poder de resolución que el gel de poliacrilamida para el ADN, pero tiene un mayor rango de separación, por lo que se utiliza para fragmentos de ADN de un tamaño generalmente entre 50 y 20.000 pb. El límite de resolución para la electroforesis estándar en gel de agarosa es de unos 750 kb, pero es posible una resolución de más de 6 Mb con la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). También puede utilizarse para separar proteínas de gran tamaño, y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos superiores a 5-10 nm. Un gel de agarosa al 0,9% tiene poros suficientemente grandes para la entrada del bacteriófago T4. miniaturadeimagen|Un gel de agarosa moldeado en bandeja, que se utilizará para la electroforesis en gel El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato. Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso denominado electroendosmosis (EEO), por lo que pueden retardar el movimiento del ADN y provocar la difuminación de las bandas. Los geles de mayor concentración tendrían un mayor flujo electroendosmótico. Por lo tanto, generalmente se prefiere la agarosa de baja EEO para su uso en la electroforesis en gel de agarosa de ácidos nucleicos, pero la agarosa de alta EEO puede utilizarse para otros fines. El menor contenido en sulfatos de la agarosa de baja EEO, en particular la agarosa de bajo punto de fusión (LMP), también es beneficioso en los casos en los que el ADN extraído del gel se va a utilizar para manipulaciones posteriores, ya que la presencia de sulfatos contaminantes puede afectar a algunos procedimientos posteriores, como la ligadura y la PCR. Sin embargo, las agarosas sin EEO son indeseables para algunas aplicaciones, ya que pueden fabricarse añadiendo grupos cargados positivamente y dichos grupos pueden afectar a las reacciones enzimáticas posteriores. La electroendosmosis es una razón por la que la agarosa se utiliza preferentemente al agar, ya que el componente de agaropectina en el agar contiene una cantidad significativa de grupos sulfato y carboxilo cargados negativamente. La eliminación de la agaropectina en la agarosa reduce sustancialmente la EEO, así como la adsorción no específica de biomoléculas a la matriz de gel. Sin embargo, para algunas aplicaciones como la electroforesis de proteínas séricas, puede ser deseable una alta EEO, y la agaropectina puede añadirse en el gel utilizado.

Migración de ácidos nucleicos en gel de agarosa

Factores que afectan a la migración del ácido nucleico en gel miniaturadeimagen|280x280px|Los geles de preparaciones de plásmidos suelen mostrar una banda principal de ADN superenrollado con otras bandas más tenues en el mismo carril. Tenga en cuenta que, por convención, el gel de ADN se muestra con los fragmentos de ADN más pequeños más cerca de la parte inferior del gel. Esto se debe a que históricamente los geles de ADN se corrían verticalmente y los fragmentos de ADN más pequeños se mueven más rápido hacia abajo. Varios factores pueden afectar a la migración de los ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel (concentración del gel), el tamaño del ADN electroforizado, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración del colorante intercalante, como el bromuro de etidio, si se utiliza durante la electroforesis.

Las moléculas más pequeñas se desplazan más rápidamente que las grandes en el gel, y el ADN bicatenario se desplaza a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes, y la separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere el uso de la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), que aplica corriente alterna desde diferentes direcciones y los fragmentos de ADN grandes se separan a medida que se reorientan con el cambio de campo.

En la electroforesis en gel de agarosa estándar, las moléculas más grandes se resuelven mejor utilizando un gel de baja concentración, mientras que las moléculas más pequeñas se separan mejor en un gel de alta concentración. Sin embargo, los geles de mayor concentración requieren tiempos de ejecución más largos (a veces días).

El movimiento del ADN puede verse afectado por la conformación de la molécula de ADN, por ejemplo, el ADN superenrollado suele moverse más rápido que el relajado porque está fuertemente enrollado y, por tanto, es más compacto. En una preparación normal de ADN plasmídico, pueden estar presentes múltiples formas de ADN. La electroforesis en gel de los plásmidos mostraría normalmente la forma superenrollada negativa como banda principal, mientras que el ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada aparecen como bandas menores. Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las distintas formas puede cambiar utilizando diferentes condiciones de electroforesis, y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más afectada que la del ADN lineal por el tamaño del poro del gel.

El bromuro de etidio que se intercala en el ADN circular puede cambiar la carga, la longitud y la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo que su presencia en el gel durante la electroforesis puede afectar a su movimiento. Por ejemplo, la carga positiva del bromuro de etidio puede reducir el movimiento del ADN en un 15%. La electroforesis en gel de agarosa puede utilizarse para resolver ADN circular con diferente topología de superenrollamiento.

El daño en el ADN debido al aumento de la reticulación también reducirá la migración electroforética del ADN de forma dependiente de la dosis.

La velocidad de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor es el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, la resolución de grandes fragmentos de ADN es menor a alto voltaje. La movilidad del ADN también puede cambiar en un campo inestable: en un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño determinado puede disminuir significativamente a una frecuencia de ciclo concreta. Este fenómeno puede dar lugar a la inversión de bandas en la electroforesis en gel con inversión de campo (FIGE), en la que los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños.

Anomalías de migración

Geles "sonrientes": este efecto de borde se produce cuando el voltaje aplicado es demasiado alto para la concentración de gel utilizada. Sobrecarga del ADN: la sobrecarga del ADN ralentiza la migración de los fragmentos de ADN. Contaminación: la presencia de impurezas, como sales o proteínas, puede afectar al movimiento del ADN.

Mecanismo de migración y separación La carga negativa de su columna vertebral de fosfato mueve el ADN hacia el ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. Sin embargo, la migración de las moléculas de ADN en solución, en ausencia de una matriz de gel, es independiente del peso molecular durante la electroforesis. La matriz de gel es, por tanto, responsable de la separación del ADN por tamaño durante la electroforesis, y existen varios modelos para explicar el mecanismo de separación de biomoléculas en matriz de gel. Uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston, que trata la matriz polimérica como un tamiz. Una proteína globular o una bobina aleatoria de ADN se mueven a través de los poros interconectados, y es más probable que el movimiento de las moléculas más grandes se vea impedido y ralentizado por las colisiones con la matriz de gel, por lo que las moléculas de diferentes tamaños pueden separarse en este proceso de tamizado.

Sin embargo, el modelo de Ogston no funciona con moléculas grandes, ya que los poros son mucho más pequeños que el tamaño de la molécula. Para moléculas de ADN de tamaño superior a 1 kb, lo más habitual es utilizar un modelo de reptación (o sus variantes). Este modelo supone que el ADN puede arrastrarse en forma de "serpiente" (de ahí lo de "reptación") a través de los poros como una molécula alargada. Sin embargo, la microscopía de fluorescencia en tiempo real de las moléculas teñidas mostró una dinámica más sutil durante la electroforesis, en la que el ADN mostraba una elasticidad considerable, ya que se estiraba alternativamente en la dirección del campo aplicado y luego se contraía en forma de bola, o se enganchaba en forma de U cuando quedaba atrapado en las fibras de polímero.

Procedimiento general Los detalles de un experimento de electroforesis en gel de agarosa pueden variar según los métodos, pero la mayoría siguen un procedimiento general. izquierda|miniaturadeimagen|240x240px|Vídeo que muestra el montaje del aparejo y la carga/ejecución del gel.

Colada de gel