Las técnicas de ingeniería genética permiten modificar los genomas de animales y plantas. Se han ideado técnicas para insertar, eliminar y modificar el ADN a múltiples niveles, desde un par de bases específico en un gen concreto hasta genes enteros. Hay una serie de pasos que se siguen antes de crear un organismo modificado genéticamente (OMG). En primer lugar, los ingenieros genéticos deben elegir qué gen desean insertar, modificar o eliminar. A continuación, deben aislar el gen e incorporarlo, junto con otros elementos genéticos, a un vector adecuado. Este vector se utiliza entonces para insertar el gen en el genoma del huésped, creando un organismo transgénico o editado.
La capacidad de diseñar organismos genéticamente se basa en años de investigación y descubrimientos sobre la función y manipulación de los genes. Entre los avances más importantes figuran el descubrimiento de enzimas de restricción, ligasas de ADN y el desarrollo de secuenciación y reacción en cadena de la polimerasa.
Los genes añadidos suelen ir acompañados de regiones promotoras y terminadoras, así como de un gen marcador seleccionable. El propio gen añadido puede modificarse para que se exprese con mayor eficacia. A continuación, el vector se inserta en el genoma del organismo huésped. En el caso de los animales, el gen suele insertarse en células madre embrionarias, mientras que en las plantas puede insertarse en cualquier tejido que pueda cultivarse hasta convertirse en una planta completamente desarrollada.
Se realizan pruebas en el organismo modificado para garantizar una integración, herencia y expresión estables. Los descendientes de la primera generación son heterocigóticos, por lo que es necesario cruzarlos para crear el patrón homocigótico necesario para una herencia estable. La homocigosis debe confirmarse en los ejemplares de segunda generación.
Las primeras técnicas insertaban los genes al azar en el genoma. Los avances permiten dirigirlos a lugares específicos, lo que reduce los efectos secundarios no deseados. Las primeras técnicas se basaban en meganucleasas y nucleasas con dedos de zinc . Desde 2009 se han desarrollado sistemas más precisos y fáciles de implementar. Las nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN) y el sistema Cas9-guideRNA (adaptado de CRISPR ) son los dos más comunes.
Historia Muchos descubrimientos y avances diferentes condujeron al desarrollo de la ingeniería genética. La manipulación genética dirigida por el hombre comenzó con la domesticación de plantas y animales mediante selección artificial en torno al año 12.000 a. C.:1 Se desarrollaron varias técnicas para ayudar en la cría y la selección. La hibridación era una forma de introducir cambios rápidos en la composición genética de un organismo. Lo más probable es que la hibridación de cultivos se produjera por primera vez cuando los humanos empezaron a cultivar individuos genéticamente distintos de especies emparentadas muy cerca unos de otros.: 32 Algunas plantas pudieron propagarse por clonación vegetativa.La herencia genética fue descubierta por primera vez por Gregor Mendel en 1865, tras realizar experimentos cruzando guisantes. En 1928, Frederick Griffith demostró la existencia de un "principio transformador" involucrado en la herencia, que fue identificado como ADN en 1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty . Frederick Sanger desarrolló un método para secuenciar el ADN en 1977, lo que incrementó enormemente la información genética disponible para los investigadores.
Tras descubrir la existencia y propiedades del ADN, hubo que desarrollar herramientas que permitieran manipularlo. En 1970, el laboratorio de Hamilton Smith descubrió las enzimas de restricción, que permitían a los científicos aislar genes del genoma de un organismo. Las ligasas de ADN, que unen el ADN roto, se habían descubierto antes, en 1967. La combinación de ambas enzimas permitió "cortar y pegar" secuencias de ADN para crear ADN recombinante. Los plásmidos, descubiertos en 1952, se convirtieron en herramientas importantes para transferir información entre células y replicar secuencias de ADN. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis en 1983, permitió amplificar (replicar) pequeñas secciones de ADN y facilitó la identificación y el aislamiento de material genético.
Además de manipular el ADN, había que desarrollar técnicas para su inserción en el genoma de un organismo. El experimento de Griffith ya había demostrado que algunas bacterias tenían la capacidad de captar y expresar ADN extraño de forma natural. En 1970 se indujo la competencia artificial en Escherichia coli tratándolas con una solución de cloruro cálcico (CaCl2). La transformación mediante electroporación se desarrolló a fines de la década de 1980, aumentando la eficacia y el alcance bacteriano. En 1907 se había descubierto una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens. A principios de los años 70 se descubrió que esta bacteria insertaba su ADN en las plantas utilizando un plásmido Ti. Al eliminar los genes del plásmido que causaban el tumor y añadir genes nuevos, los investigadores pudieron infectar las plantas con A. tumefaciens y dejar que la bacteria insertara el ADN que habían elegido en los genomas de las plantas.
Elección de genes diana El primer paso consiste en identificar el gen o genes diana que se insertarán en el organismo huésped. Esto depende del objetivo del organismo resultante. En algunos casos sólo se ven afectados uno o dos genes. Para objetivos más complejos pueden estar implicadas vías biosintéticas enteras en las que intervienen múltiples genes. Una vez encontrados, los genes y otra información genética de una amplia gama de organismos pueden insertarse en bacterias para su almacenamiento y modificación, creando bacterias modificadas genéticamente en el proceso. Las bacterias son baratas, fáciles de cultivar, clonales, se multiplican rápidamente, relativamente fáciles de transformar y pueden almacenarse a -80 °C casi indefinidamente. Una vez aislado un gen, puede almacenarse en el interior de la bacteria, lo que proporciona un suministro ilimitado para la investigación.
Se pueden realizar cribas genéticas para determinar genes potenciales, seguidas de otras pruebas que identifiquen a los mejores candidatos. Una criba sencilla consiste en mutar aleatoriamente el ADN con sustancias químicas o radiaciones y luego seleccionar los que presentan el rasgo deseado. Para los organismos en los que la mutación no resulta práctica, los científicos buscan en su lugar individuos de la población que presenten la característica a través de mutaciones que se producen de forma natural. Los procesos que analizan un fenotipo e intentan identificar el gen responsable se denominan genética directa. A continuación hay que localizar el gen comparando la herencia del fenotipo con marcadores genéticos conocidos. Es probable que los genes cercanos se hereden juntos.
Otra opción es la genética inversa. Este enfoque consiste en atacar a un gen específico con una mutación y luego observar qué fenotipo se desarrolla. La mutación puede diseñarse para inactivar el gen o solo permitir que se active bajo ciertas condiciones. Las mutaciones condicionales son útiles para identificar genes que normalmente son letales si no funcionan. Como los genes con funciones similares comparten secuencias similares ( homólogas ), es posible predecir la función probable de un gen comparando su secuencia con la de genes bien estudiados de organismos modelo. El desarrollo de micromatrices, transcriptomas y la secuenciación del genoma ha facilitado mucho la búsqueda de genes deseables.
La bacteria Bacillus thuringiensis se descubrió por primera vez en 1901 como agente causante de la muerte de gusanos de seda. Debido a estas propiedades insecticidas, la bacteria se utilizó como insecticida biológico, desarrollado comercialmente en 1938. En 1956 se descubrieron las proteínas cry que proporcionan la actividad insecticida, y en la década de 1980 los científicos habían clonado con éxito el gen que codifica esta proteína y lo habían expresado en plantas. El gen que proporciona resistencia al herbicida glifosato se encontró tras siete años de búsqueda en bacterias que vivían en el tubo de desagüe de una planta de fabricación de RoundUp de Monsanto. En los animales, la mayoría de los genes utilizados son genes de la hormona del crecimiento.
Manipulación de genes Todos los procesos de ingeniería genética implican la modificación del ADN. Tradicionalmente, el ADN se aislaba de las células de los organismos. Más tarde, los genes pasaron a clonarse a partir de un segmento de ADN tras la creación de una biblioteca de ADN o sintetizarse artificialmente. Una vez aislados, se añaden elementos genéticos adicionales al gen para permitir su expresión en el organismo huésped y ayudar a la selección.
Extracción a partir de células
En primer lugar, la célula debe abrirse suavemente para exponer el ADN sin dañarlo demasiado. Los métodos utilizados varían en función del tipo de célula. Una vez abierta, hay que separar el ADN de los demás componentes celulares. Una célula rota contiene proteínas y otros restos celulares. Mezclando con fenol y/o cloroformo, seguido de centrifugación, los ácidos nucleicos pueden separarse de estos restos en una fase acuosa superior. Esta fase acuosa puede eliminarse y purificarse aún más si es necesario repitiendo los pasos de fenol-cloroformo. A continuación, los ácidos nucleicos pueden precipitarse de la solución acuosa con etanol o isopropanol. Cualquier ARN puede eliminarse agregando una ribonucleasa que lo degrade. Muchas empresas venden ahora kits que simplifican el proceso.
Aislamiento de genes El gen que los investigadores pretenden modificar (conocido como gen de interés) debe separarse del ADN extraído. Si no se conoce la secuencia, un método habitual es romper el ADN con un método de digestión aleatoria. Para ello se suelen utilizar enzimas de restricción (enzimas que cortan el ADN). Una digestión de restricción parcial corta sólo algunos de los sitios de restricción, lo que da lugar a segmentos de fragmentos de ADN superpuestos. Los fragmentos de ADN se introducen en vectores plasmídicos individuales y se cultivan dentro de bacterias. Una vez en la bacteria, el plásmido se copia a medida que la bacteria se divide. Para determinar si un gen útil está presente en un fragmento concreto, se analiza la biblioteca de ADN en busca del fenotipo deseado. Si se detecta el fenotipo, es posible que la bacteria contenga el gen diana.
Si el gen no tiene un fenotipo detectable o una biblioteca de ADN no contiene el gen correcto, deben utilizarse otros métodos para aislarlo. Si la posición del gen puede determinarse mediante marcadores moleculares, una forma de aislar el fragmento de ADN correcto es realizar un recorrido cromosómico. Si el gen expresa una homología cercana a un gen conocido de otra especie, entonces podría aislarse buscando genes en la biblioteca que coincidan estrechamente con el gen conocido.