Los péptidos de penetración celular (CPPs, por sus siglas en inglés) son péptidos cortos que facilitan la admisión de varias cargas moleculares (desde nano-partículas hasta pequeñas moléculas químicas y fragmentos de ADN largos). La "carga" está asociada a los péptidos a través de uniones químicas vía enlaces covalentes o a través de interacciones no covalentes. La función de las CPPs es entregar la carga hacia el interior de las células, un proceso que comúnmente ocurre a través de la endocitosis con la carga entregada a los endosomas de las células mamíferas vivas.
Los CPPS presentan gran potencial como vectores de administración de forma in vitro como in vivo para su uso en investigación y medicina. Actualmente se están limitados debido a la falta de especificidad celular en la administración de carga mediada por CPP y la insuficiencia en el entendimiento en los modos de la admisión.
Usualmente los CPPs están compuestos por aminoácidos que contienen una carga positiva relativa abundante como la lisina o la arginina o que contengan una secuencia de patrones alternados entre aminoácidos polares y no polares, aminoácidos hidrofóbicos. A estos dos tipos de estructuras se les conoce como policatiónica o anfipática, respectivamente. Una tercera clase de CPPs son los péptidos hidrofóbicos, que contienen únicamente residuos apolares, con baja carga neta o que tienen grupos de aminoácidos hidrofóbicos que son cruciales para la admisión celular.Milletti F (2012) Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17: 850–860.Stalmans, Sofie; Wynendaele, Evelien; Bracke, Nathalie; Gevaert, Bert; D'Hondt, Matthias; Peremans, Kathelijne; Burvenich, Christian; De Spiegeleer, Bart. Chemical-Functional Diversity in Cell-Penetrating Peptides.PLOS ONE Volume: 8 Issue: 8 Article Number: e71752
El primer CPP se descubrió de manera independiente por dos laboratorios en 1988, cuando se descubrió que el transactivador de la transcripción génica (TAT, por sus siglas en inglés) del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (HIV-1) podía ser tomado de manera eficiente del medio circundante por numerosos tipos de células en cultivo.Protein Transduction: Cell Penetrating Peptides and Their Therapeutic Applications; Wagstaff, Kylie M.; Jans, David A; Current Medicinal Chemistry, Volume 13, Number 12, May 2006 , pp. 1371-1387(17) Desde entonces, el número de CPPs se ha expandido considerablemente y se han generado pequeñas moléculas con proteínas con mayor efectividad en las propiedades transducción.Okuyama, M. and Laman, H. and Kingsbury, S.R. and Visintin, C. and Leo, E. and Eward, K.L. and Stoeber, K. and Boshoff, C. and Williams, G.H. and Selwood, D.L. (2007) Small-molecule mimics of an α-helix for efficient transport of proteins into cells. Nature Methods, 4 (2). pp. 153-159
Mecanismos para la translocación membranal
Los péptidos de penetración celular son de diferentes tamaños, secuencias de aminoácidos y cargas, pero todos los CPPs tienen una característica distintiva, la cual es la habilidad de translocar la membrana plasmática y facilitar la administración de cargas moleculares al citoplasma o a órganelos. No ha habido un consenso real acerca del mecanismo de la translocación por CPPs, pero las teorías se clasifican en tres principales mecanismos: penetración directa de la membrana, entrada mediada por endocitosis, y la translocación a través de la formación de estructuras transitorias. La transducción es un área con investigación en curso.. Opalinska, J. B.; Gewirtz, A. M. Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications. Nat. Rev. Drug Discov. 2002, 1, 503-514Eckstein, F. The versatility of oligonucleotides as potential therapeutics. Expert. Opin. Biol. Ther. 2007, 7, 1021-1034.
Los CPPs son capaces de transportar diferentes cargas moleculares a través de la membrana; en consecuencia, actúan como vehículos de administración moleculares. Los CPPs tienen numerosas aplicaciones en a medicina como agentes de administración de fármacos para el tratamiento de diferentes enfermedades, incluyendo al cáncer, inhibidores virales, así como agentes de contraste para marcar células. Ejemplos incluyen el actuar como carriers para GFP, agentes de contraste MRI o puntos cuánticos.Stewart, K., M., Hortonb, K., L., O. Kelley S., O., Org. Biomol. Chem., 2008, 6, 2242–2255
Penetración directa La mayoría de la investigación inicial sugería que la translocación de los CPPs policatiónicos a través de la membrana biológica ocurría vía un proceso celular independiente de energía. Se creía que la translocación podía llevarse a cabo a 4 °C y que lo más seguro es que involucraba una interacción electrostática directa con fosfolípidos cargados de forma negativa. Investigadores propusieron diferentes modelos en un intento de elucidar el mecanismo biofísico de este proceso independiente de energía, Aunque los CPPs promueven efectos directos en las propiedades biofísicas de sistema puro de membrana, la identificación de artefactos fijados cuando se usan CPPs de sondas marcadas fluorescentemente causó que se hiciera una revaluación del mecanismo del importe de CPPs.Luo, D.; Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 2000, 18, 33-37. Estos estudios promueven la endocitosis como la vía de translocación. Un ejemplo de la penetración directa se ha propuesto para TAT. EL primer paso en este modelo propuesto es la interacción con proteínas de fusión no dobladas (TAT) y la membrana a través de interacciones electrostáticas, que desbarata suficientemente la membrana para permitir que las proteínas de fusión crucen. Después de la internalización las proteínas de fusión se repliegan debido a un sistema de chaperón. Este mecanismo no se aceptó y otros mecanismos involucrando una endocitosis dependiente de clatrina se han sugerido.Vives, E., Brodin, P. and Lebleu, B. (1997) J. Biol. Chem. 272, 16010–16017Zelphati O. and Szoka F. C. Jr (1996) Intracellular distribution and mechanism of delivery of oligonucleotides mediated by cationic lipids. Pharm. Res. 13: 1367–1372 thumb|Ejemplo de la translocación de carga a través de penetración directa.|400px
Recientemente, un modelo detallado de la translocación directa a través de la membrana plasmática se ha propuesto.H. D. Herce & A. E. Garcia (2007) PNAS, 104, 20805H. D. Herce & A. E. Garcia (2008) Journal of Biological Physics, 33, 345 Este mecanismo involucra interacciones fuertes entre los péptidos de penetración celular y los grupos fosfato en los dos lados de la bicapa lipídica, la inserción de cadenas laterales con cargas que nuclean la formación de un poro transitorio, seguido por la translocación del péptido al difundirse por la superficie del poro. Este mecanismo explica como ingredientes clave, como la cooperatividad entre péptidos, la gran carga positiva y específicamente los grupos guanidinio, contribuyen a la admisión. El mecanismo propuesto también ilustra la importancia de las fluctuaciones membranales. En efecto los mecanismos que involucran grandes fluctuaciones en la estructura membranal como los poros de transición y la inserción de cadenas laterales de aminoácidos cargados, pueden ser comunes y posiblemente centrales en la función de muchas proteínas de membrana. Este modelo contiene muchas características con controversia, siendo el más notorio, la generación de poros de transición que facilita la difusión de péptidos a través de la membrana o el vesícula endosomal hacia el citosol. Datos experimentales recientes validan este ingrediente clave del modelo, mostrando que los CPPs generan los poros de transición en la bicapa lipídica y en células vivas.H. D. Herce et al (2009) Biophysical Journal, 97, 1917-1925 arXiv:0910.1736v1
Translocación mediada por endocitocis
La endocitosis es el segundo mecanismo responsable de la internalización celular. La endocitosis es el proceso de la ingestión celular con la cual la membrana plasmática se pliega hacia adentro para atraer sustancias hacia la célula. Durante este proceso la célula absorbe material del exterior al introducirla a su membrana. La clasificación de la localización celular usando fluorescencia o con inhibidores de la endocitosis es la base de cualquier examen. Sin embargo, el procedimiento usado durante la preparación de estas muestras crea información cuestionable con referencia a la endocitosis. Por otra parte, estudios muestran que la entrada de penetratina por endocitosis es un proceso dependiente de energía. Este proceso es iniciado por poliargininas interactuando con sulfato de heparán que promueven la endocitosis. La investigación muestra que TAT es introducido mediante una forma de endocitosis llamada macropinocitosis.Frankel, A. D.; Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell 1988, 55, 1189-1193Lundberg M. and Johansson M. (2001) Is VP22 nuclear homing an artifact? Nat. Biotechnol. 19: 713–714
Estudios han enseñado que la endocitosis está involucrada en la internalización de CPPs, pero se ha sugerido que diferentes mecanismos pueden ocurrir al mismo tiempo. Esto establece por el comportamiento reportado para la penetratina y transpotan ocurre la translocación de membrana y la endocitosis simultáneamente.Lundberg M., Wikstrom S. and Johansson M. (2003) Cell surface adherence and endocytosis of protein transduction domains. Mol. Ther. 8: 143–150J. Howl, I.D. Nicholl, Biochem. Soc. Trans (2007) 35, 767-769
Translocación mediante la formación de estructuras transitorias
thumb|Translocación mediada por la formación de micelas invertidas|400px El tercer mecanismo responsable de la translocación está basado en la formación de micelas invertidas. Estos son agregados de surfactantes coloides donde los grupos polares se concentran en el interior y los grupos lipofílicos se extienden afuera hacia el solvente. De acuerdo con este modelo, un dímero de penetratina se combina con fosfolípidos con carga negativa, así generando la formación de micelas invertidas dentro de la bicapa lipídica. La estructura de estas micelas permite al péptido permanecer dentro del ambiente hidrofílico.Plenat T., Deshayes S., Boichot S., Milhiet P. E., Cole R., Heitz F. et al. (2004) Interaction of primary amphipathic cellpenetrating peptides with phospholipid-supported monolayers. Langmuir 20: 9255–9261Deshayes S., Gerbal-Chaloin S., Morris M. C., Aldrian-Herrada G., Charnet P., Divita G. et al. (2004) On the mechanism of non-endosomial peptide-mediated cellular delivery of nucleic acids. Biochim. Biophys. Acta 1667: 141–147Deshayes S., Heitz A., Morris M. C., Charnet P., Divita G. and Heitz F. (2004) Biochemistry 43: 1449–1457 No obstante este mecanismo sigue siendo asunto de debate, debido a que la distribución de la penetrina entre el interior y exterior de la membrana es no-simétrico. Esta distribución no-simétrica produce un campo eléctrico que se ha establecido de forma correcta. Incrementando la cantidad de péptidos en los prospectos exteriores de la membrana causa que el campo eléctrico alcance un valor crítico que genera un evento parecido a la electroporación.