La Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple (PCR Múltiple) es una variante de la PCR tradicional (PCR punto final) en la que dos o más loci se amplifican simultáneamente en la misma reacción. Es una técnica de biología molecular usada en todo el mundo que usa la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar distintos fragmentos de ADN diana simultáneamente (como si se realizaran muchas reacciones en cadena de la polimerasa individuales en una misma reacción). La amplificación de las dianas se logra mediante el uso de múltiples pares de cebadores en una mezcla de reacción; el diseño de los cebadores para todos los pares de estos tiene que ser optimizado para que pueden trabajar a la misma temperatura de hibridación durante la PCR. La PCR Múltiple tiene el potencial de ahorrar considerablemente tiempo y esfuerzo en el laboratorio, sin comprometer la utilidad del experimento. Desde su primera descripción en 1988, este método se ha aplicado con éxito en muchas áreas de diagnóstico de ácidos nucleicos, incluidos el análisis de deleción de genes, mutaciones, polimorfismos, ensayos cuantitativos, detección de RNA y PCR de transcripción inversa. Kits de alcance comercial para realizar PCR Múltiple están disponibles y son utilizados por muchos laboratorios forenses para amplificar muestras de ADN degradadas. En el campo de las enfermedades infecciosas, esta técnica ha demostrado ser un método valioso para la identificación de virus, bacterias, hongos, y parásitos. Historia La PCR Múltiple fue descrita por primera vez en 1988 por Chamberlain, Gibbs, Ranier, Nguyen y Caskey como un método para detectar deleciones en el gen de la distrofina (uno de los genes humanos más largo que se conocen, con 2,5 megabases), que son la causa de la Distrofia Muscular de Duchenne. En 1990, Ballabio, Ranier, Chamberlain, Zollo, and Caskey la usaron como método de screening para encontrar deleciones en el gen de la esteroide sulfatasa (STS). En 2008, La PCR Múltiple fue utilizada para el análisis de microsatélites y SNPs, entre muchas otras áreas.

La PCR, en general, ha revolucionado el campo del diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Para superar la desventaja inherente del alto costo y para mejorar la capacidad diagnóstica de la prueba, se ha desarrollado la PCR Múltiple para la detección de agentes infecciosos virales, bacterianos y fúngicos en un tubo de reacción. Los esfuerzos para mejorar la sensibilidad y especificidad, y para facilitar la automatización del proceso han dado lugar a numerosas publicaciones relacionadas con la aplicación de la PCR Múltiple en el diagnóstico de agentes infecciosos, especialmente aquellos que se dirigen a ácidos nucleicos virales.

Fundamento La PCR Múltiple consta de varios conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de tamaños que son específicos para varias secuencias de ADN diferentes. Aunque no está claro si hay un límite teórico para el número de secuencias que pueden amplificarse simultáneamente, las limitaciones en el establecimiento de condiciones para reacciones específicas e interpretables generalmente limitan el número de secuencias diana útiles. Una reacción de PCR Múltiple para amplificar tanto como nueve segmentos del gen de la distrofina humana ya ha sido reportado con anterioridad.

El desarrollo de la PCR Múltiple debería seguir un enfoque racional para sus condiciones, tales como la compatibilidad entre los cebadores dentro de la mezcla de reacción de tal manera que no haya interferencias entre ellos, lo cual es de gran importancia técnica. Por lo tanto, el diseño de los conjuntos de cebadores de acuerdo con unos parámetros claramente identificados es esencial para una amplificación específica con alto rendimiento.

Las temperaturas de hibridación para cada uno de los conjuntos de cebadores deben ser optimizadas para que puedan funcionar correctamente dentro de una sola reacción, utilizando los pares de cebadores que resulten en productos de PCR que pueden ser separados y visualizados claramente mediante electroforesis en gel o hibridación de sondas con máxima especificidad. Alternativamente, si los tamaños de los amplicones se superponen, los diferentes amplicones pueden diferenciarse y visualizarse usando cebadores que se han teñido con diferentes colores de marcas fluorescentes.

Parámetros Importantes

Diseño de Cebadores La longitud del cebador debe ser de 18 a 24 pares de bases y debe tener un contenido de GC de entre el 40 % y el 60 %, por lo tanto deberían de tener una temperatura de hibridación de 55 °C a 58 °C. Los cebadores más largos, de entre 28 y 30 pares de bases, permiten que la reacción se realice a una temperatura de hibridación más alta, pero los rendimientos de los productos resultarán ser inespecíficos, o se dará la formación de dímeros de cebadores. Se recomienda calcular el punto de fusión y hacer pruebas para posibles interacciones cebador-cebador. También se recomienda hacer pruebas de posibles secuencias repetitivas, intente alineación de cebadores con las bases de datos de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, por sus siglas en inglés) usando la familia de programas de la Herramienta de Búsqueda de Alineación Básica Local (BLAST, por sus siglas en inglés).

Temperatura de Fusión Se utilizan cebadores con la temperatura de fusión similar, preferiblemente entre 55 °C y 60 °C. Para las secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan cebadores con una temperatura de fusión más alta (preferiblemente de 75 °C a 80 °C). Una variación de entre 3 °C y 5 °C es aceptable para los cebadores utilizados en la reacción.

Especificidad Es importante tener en cuenta la especificidad de los cebadores diseñados con las secuencias diana, mientras se realiza la preparación de una PCR Múltiple, sobre todo porque existe competencia cuando múltiples secuencias diana están en un solo recipiente de reacción.

Evitar la Formación de Dímeros de Cebadores Los cebadores diseñados deben ser revisados para que no ocurra la formación de dímeros de cebadores, ya que con todos los que habrá presentes en la mezcla de reacción, si llega a haber dimerización, esta conduce a la amplificación inespecífica de fragmentos.

Evitar el Uso de Cebadores Anidados Las PCR Múltiples deben evitar el uso de cebadores anidados que requieren una segunda ronda de amplificación. Esto es un importante contribuyente de los resultados con falsos positivos debido a la contaminación por arrastre, aunque protocolos anti-contaminación incluyendo controles de PCR (reacción y las muestras extraídas de controles) deben ser implementadas en todos los protocolos basados en la PCR. Del mismo modo, las precauciones y metodologías para evitar resultados falsos negativos debido a la insuficiencia de reacción tienen que ser considerados. Las PCR Múltiple que amplifican secuencias diana junto con la presencia de ácidos nucleicos diana de control externos o internos que indican la insuficiencia de reacción ya se han desarrollado y han sido también ampliamente utilizados.

Tipos de PCR Múltiple Las reacciones múltiples pueden ser categorizadas en dos grupos:

1. Reacción en Cadena de la Polimerasa de Templete Único

Esta técnica utiliza una única plantilla que puede ser un ADN genómico junto con varios pares de cebadores directo e inverso para amplificar regiones específicas dentro de un templete.

2. Reacción en Cadena de la Polimerasa de Múltiples Templetes

Se utilizan múltiples plantillas y varios conjuntos de cebadores en el mismo tubo de reacción. La presencia de múltiples cebadores puede dar lugar a hibridación cruzada entre sí y así propiciar la posibilidad de errores de alineación con otras plantillas.

Ventajas 1. Controles Internos

Los problemas potenciales en una PCR simple incluyen falsos negativos debido a alguna falla en reacción o falsos positivos debido a alguna contaminación. Los falsos negativos a menudo se revelan en ensayos múltiples porque cada amplicón proporciona un control interno para los otros fragmentos amplificados.

2. Eficiencia

El gasto de los reactivos y el tiempo de preparación es menor en una PCR Múltiple que en los sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR. Una reacción múltiple es ideal para la conservación de la polimerasa, que es costosa y de plantillas con escasa cantidad.

3. Calidad del Templete

La calidad el templete puede determinarse de manera más eficaz en una PCR Múltiple que en una reacción simple de PCR.

4. Cantidad del Templete

La amplificación exponencial y los estándares internos de la PCR Múltiple se pueden utilizar para evaluar la cantidad de una plantilla determinada en una muestra. Para cuantificar las plantillas con precisión por PCR Múltiple, la cantidad de plantilla de referencia, el número de ciclos de reacción y la inhibición mínima de la duplicación teórica de producto para cada ciclo deben tenerse en cuenta.

5. Cantidad Limitada de Templete

La cantidad de extracto disponible de ADN antiguo es limitado y solo permite unos cuantos ensayos de PCR. El protocolo de la PCR Múltiple permite varios órdenes de magnitud de mayor información para ser deducidas de cantidades limitadas de plantilla. Esto se logra mediante la amplificación de un número casi ilimitado de fragmentos de la misma cantidad de plantilla de ADN como se utilizaría para un producto de PCR estándar único.

6. Modificaciones

En primer lugar, debido a su alta especificidad cuando se utilizan cebadores anidados, un muy alto número de loci puede ser amplificado simultánea- y rápidamente sin la necesidad de la optimización previa de las diferentes combinaciones de cebadores. La alta especificidad es proporcionada por cebadores anidados, que imponen un nivel adicional de selección de secuencia en los productos de la primera PCR. Este diseño reduce sustancialmente la aparición de espurios de cebadores y falsos positivos debido a la amplificación no específica o amplificación de ADN contaminante a partir de especies diferentes a la especie objetivo. En segundo lugar, solo los fragmentos más cortos (anidados) de la segunda etapa se amplifican a un alto número de copias. Por lo tanto, el riesgo de contaminación cruzada de muestras posteriores con productos de la PCR se reduce, ya que estos productos más cortos no pueden servir como plantillas para la primera etapa.

7. Aplicaciones

Tales como la amplificación paralela de múltiples locis cortos que no presentan solapamiento, por lo que se puede utilizar un único conjunto de cebadores múltiples. La técnica también puede ser adaptada para el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), por ejemplo para inferir la selección positiva, la distribución geográfica de los alelos o cambios en la distribución del alelo en un tiempo y en un espacio determinados. Recientemente, se ha propuesto que la secuenciación de un genoma completo de una especie extinguida utilizando la técnica 454 proporcionará un gran número de SNPs para especies extintas. El protocolo de PCR Múltiple de dos etapas proporciona un método para la evaluación rápida de algunos SNPs candidatos y la posterior tipificación en paralelo de cientos o miles de SNPs de una muestra. Usando fuentes complejas de ADN, tales como las heces o sedimentos, también podría ser posible amplificar el ADN de especies diferentes, tales como plantas, animales y bacterias simultáneamente. Finalmente, este método tiene muchas aplicaciones en medicina forense, ya que permite el análisis simultáneo de múltiples marcadores tales como el ADN mitocondrial, los marcadores específicos del sexo, microsatélites y SNPs de las muestras de cantidad limitada.

Desventajas 1. Número limitado de pares de cebadores