miniatura|500px|derecha|Diagrama del posible mecanismo de los CRISPR. CRISPR (en inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, en español: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) es una familia de secuencias de ADN de origen viral que se encuentran integradas en el genoma de los organismos procariotas. Dichas secuencias consisten en fragmentos de ADN de virus bacteriófagos que han infectado a bacterias y arqueas en el pasado y que estas han incluido en su propio genoma. Estos fragmentos son utilizados por la célula procariota en el futuro para detectar y destruir el material genético de virus infecciosos similares mediante proteínas que, con base en las secuencias integradas de ataques anteriores, reconocen y cortan el nuevo ADN viral dejándolo inutilizado, funcionando como un sistema inmunitario de defensa procariota eficaz y altamente específico. Además de jugar un papel clave en los sistemas de defensa bacterianos, estas secuencias formaron la base de una revolucionaria tecnología de vanguardia conocida como CRISPR/Cas, que es capaz de modificar los genes de cualquier organismo utilizando una familia de enzimas con actividad endonucleasa asociadas a CRISPR conocidas como Cas, tal como la Cas9 del sistema CRISPR/Cas9.
En términos más técnicos, los arreglos CRISPR son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Tras cada repetición siguen segmentos cortos de "ADN espaciador" proveniente de exposiciones previas a un virus. Se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomas bacterianos y en el 90% de los genomas secuenciados de las arqueas.CRISPRdb 71/79 Archaea, 463/1008 Bacteria , Date: 19.6.2010 Con frecuencia se hallan asociados con los genes cas que codifican para proteínas nucleasas conocidas como Cas relacionadas con los CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es un sistema inmunitario procariótico que confiere resistencia a agentes externos como plásmidos y bacteriófagos y provee una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores de los CRISPR reconocen secuencias específicas y guían a las nucleasas Cas para cortar y degradar esos elementos génicos exógenos de una manera análoga al ARNi en sistemas eucarióticos.
Desde 2013 el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies. Al administrar la proteína Cas9 y los ARN guía apropiados a una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán complementarias a las de los ARN guía utilizados. Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética. Los investigadores plantean que los CRISPRs quizás puedan usarse para construir sistemas de entrega de genes guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.
Antecedentes Las bacterias pueden incorporar ADN externo en otras circunstancias e incluso pueden tomar ADN dañado de su medio.
Las secuencias repetidas que luego se conocerían como CRISPR fueron identificadas por primera vez por un grupo de científicos japoneses en 1987 (Yoshizumi Ishino et al).http://jb.asm.org/content/169/12/5429.long Nucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product y luego más tarde de forma independiente por el científico Francisco J. M. Mojica (Universidad de Alicante) a principios de los años 90 en una arquea Haloferax mediterranei y los resultados fueron publicados en 1993, tras haber sido anteriormente descritas en bacterias (Escherichia coli y Mycobacterium bovis). Inicialmente fueron utilizadas para el tipado de bacterias, para diferenciar distintos aislados, cepas y especies. Estudios iniciales por Francisco J. M. Mojica y colaboradores postularon el posible papel de estas secuencias en la partición de replicones. En el año 2000, Francisco J. M. Mojica y colaboradores detectaron un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias, arqueas y mitocondrias y propusieron el nombre de Short Regularly Spaced Repeats (SRSR, en castellano "Repeticiones Cortas Regularmente Espaciadas". Pocos años después, Francisco J. M. Mojica propuso y acuñó el acrónimo CRISPR (del inglés: Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats), propuesta que quedó recogida en una publicación de microbiólogos holandeses en 2002 y que sería utilizada universalmente desde entonces para referirse a estas secuencias. También, en la misma publicación, se describió por vez primera un conjunto de genes, algunos de los cuales codifican nucleasas o helicasas putativas, asociados a las secuencias repetidas CRISPR (los genes cas o asociados a CRISPR: del inglés: CRISPR associated).
miniatura|Diagrama simplificado de un locus CRISPR, donde se muestran sus tres componentes mayoritarios: los genes cas, una secuencia líder y un arreglo de repeticiones-espaciadores. las repeticiones se muestran como cajas grises y los espaciadores son las barras de color. El arreglo de esos tres componentes no siempre es como se muestra. Además, en el mismo genoma pueden presentarse varios CRISPRs con un DR similar, de los cuales solo uno esté asociado con los genes cas.
En 2005, tres grupos de investigación independientes mostraron que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN de fagos y ADN extracromosomal como los plásmidos. Nuevamente fue el grupo de Francisco J. Mojica quien primero se dio cuenta de que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados podían formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos procarióticos, quien primero estableció la relación entre CRISPR e inmunidad. Esas observaciones clave indican que el sistema CRISPR/cas puede tener un rol en la inmunidad adaptativa en las bacterias. Koonin y sus asociados propusieron que los espaciadores sirven como plantilla para moléculas de ARN, análogo a un sistema que usan los eucariontes llamado interferencia por ARN.
En 2007 Barrangou, Horvath (científicos de la industria alimenticia en Danisco) y el grupo de Moineau en la Université Laval (Canadá) mostraron que podían alterar la resistencia de Streptococcus thermophilus a ataques de fagos con ADN espaciador.
Cas9 Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier, ganadoras del Premio Nobel de Química 2020, junto con Francisco Juan Martínez Mojica, habían estado explorando de manera independiente a las proteínas asociadas a CRISPR para aprender cómo las bacterias utilizan a los espaciadores en sus sistemas inmunes. Juntos estudiaron un sistema CRISPR más simple que se basa en una proteína llamada Cas9. Encontraron que las bacterias responden ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula de ARN y que entonces la célula utilizaba un ARN llamado Trans-activating crRNA (tracrRNA) y también Cas9 para cortarla en pedazos llamados ARNcr.
Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte activos (HNH y RuvC), uno para cada hebra de la doble hélice. El equipo demostró que podrían desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser específico para su ADN objetivo. Jinek combinó al tracrRNA y ARN espaciador para formar una molécula llamada single-guide RNA que, al combinarse con Cas9, podía encontrar y cortar los blancos correctos de ADN. Jinek propuso que estos ARN guía sintéticos podrían usarse para la edición de genes.
La primera vez que se mostró que CRISPR funcionaba como una herramienta de ingeniería genética en cultivos de células humanas fue en 2012. Desde entonces se ha utilizado en muchos organismos, incluida la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae), el pez cebra (Danio rerio), la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), nematodos (Caenorhabditis elegans) plantas y ratones, entre otros.
Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes.
Existen ahora librerías con decenas de miles de ARN guía.
La primera evidencia de que CRISPR puede revertir síntomas de enfermedad en organismos vivos fue demostrada en marzo de 2014, cuando investigadores del MIT curaron a ratones de desórdenes genéticos del hígado.
Cas12a (anteriormente Cpf1) En 2015, la nucleasa Cpf1 se descubrió en el sistema CRISPR/Cpf1 de la bacteria Francisella novicida. Cpf1 mostró varias diferencias claves de Cas9 incluyendo: causando un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra, en oposición al corte 'brusco' producido por Cas9, basándose en un PAM rico en T (proporcionando sitios de orientación alternativos a Cas9) y requiriendo solamente Un CRISPR ARN (CRRNA) para el éxito de la orientación. Por el contrario Cas9 requiere tanto crARN y un crARN trans activado (tracrRNA)).
Actualmente esta nucleasa recibe el nombre de Cas12a, y presenta algunas variantes en función del organismo de origen, entre las que se encuentran AsCas12a (presente en la bacteria Acidaminococcus), y LbCas12a (presente en Lachnospiraceae bacterium). Además, en esta última variante se descubrió una mutación puntual, D156R, que representa la sustitución del aminoácido ácido aspártico por arginina en la posición 156 de la proteína. Cas12aD156R muestra un aumento en la eficiencia de corte en el modelo vegetal Arabidopsis thaliana, similar al que después se corroboró en D. melanogaster, generando una eficiencia en la tasa de edición génica próxima a la observada en Cas9.
CasΦ Se trata de una nucleasa hipercompacta descrita en 2020 que representa la mitad del peso molecular de Cas9/Cas12 y con características similares en su utilización como herramienta para la edición génica. Además, se ha adaptado de forma exitosa a la edición in vivo en Drosophila melanogaster de forma precisa sin generar cortes en el ADN de doble cadena.
Predecesores para edición génica Al inicio de la década de los 2000, investigadores desarrollaron las nucleasas con dedos de zinc, proteínas sintéticas cuyas regiones de unión a ADN les permitían cortar el ADN en puntos específicos. Después, las nucleasas sintéticas llamadas TALENs dieron una vía más sencilla para llegar a ADN específico y se predijo que sobrepasarían a las de los dedos de zinc. Ambas dependen de la elaboración de proteínas específicas para cada ADN objetivo, un procedimiento bastante más complicado que los ARN guía. Los CRISPRs son más eficientes y pueden llegar a más genes que ambas técnicas.
Primera edición génica comunicada en julio de 2017 El 12 de julio de 2017 la revista británica Nature comunicó un trabajo recibido el 22 de agosto de 2016, comunicando que investigadores de la Universidad de Harvard modificaron en el genoma de un grupo de bacterias, por medio de corta-pega o copipasteo genético logrado con la técnica CRISPR, la información digital de una fotografía y un GIF o animación corta. Después secuenciaron el ADN de los microorganismos para recuperar la imagen y el video con una precisión del 90%. El avance atrajo nuevo interés científico en el campo de la ‘grabación molecular’ y en particular conjeturas, al parecer prematuras e inexactas, sobre la memorización en sistemas accedidos desde un psiquismo.
Estructura del locus
Repeticiones y espaciadores